一种耐高温超氧化物歧化酶的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法及其应用，其特征在于：采用以下步骤：A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗、粉碎、过网，制得得条斑紫菜浆料；B、制备NB液体培养基；C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，得枯草芽孢杆菌种子液；D、一次发酵：发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；E、二次发酵：得第三条斑紫菜发酵液；F、分离提纯：将步骤F所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器和蛋白液相系统，分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。本发明专利技术制备的耐高温超氧化歧化酶80℃和90℃时酶活力稳定、无损失，具有耐高温，稳定性好的优点，添加到化妆品中具有抗衰老作用。

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温超氧化物歧化酶的制备方法及其应用
本专利技术涉及微生物发酵
，特别涉及一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法及其应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员之一，广泛分布在微生物、植物和动物体内。它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。由于人的皮肤直接与氧气接触，活性氧类自由基堆积或清除产生障碍都会引起细胞损伤以及色素沉着，导致皮肤衰老和损伤。通过补充外源SOD，可起到抗氧化、祛色斑的作用，有利于延缓皮肤衰老。因此，SOD可广泛应用于抗衰老护肤类产品中，应用前景广阔。但目前，由于商品化的SOD热稳定性差，易失活，极大限制其功能的正常发挥，导致市场需求受到影响。此外，市场上流通的SOD大多来源于动物血液，容易受到污染，产生细菌内毒素，从而引发热源性问题，且生产量小，成本高。而微生物发酵则是一种反应温和可控、容易放大、安全环保的生物反应过程。通过选择合适的微生物，能在发酵过程中将海藻细胞破壁，充分释放出细胞内的生物活性物质。条斑紫菜（P.yezoensisUeda）是一种具有很高科学研究价值的经济海藻，具有独特的生物学特性。条斑紫菜为潮间带大型藻类，生长在潮间带的岩石上。由于其生存环境的特殊性，随着潮汐作用，周期性的经历海水和空气两种截然相反环境条件的变化，面临失水、高渗、强光和营养限制等逆境胁迫，体内形成了与环境相适应的独特代谢途径和抗氧化酶系。SOD作为抗氧化酶系统成员之一，在抵御外界逆境胁迫中有相当重要的作用。该酶活性的高低与生物抗逆性和抗辐射能力有关。然而，目前为止海藻液的提取多是基于酸、碱法，该方法不仅提取率低，更重要的是酸碱的使用会带来一系列污废处理的问题，提高成本的同时对环境污染破坏严重。此外，考虑到基因工程成本高、操作复杂，以及其安全性有待考究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种利用条斑紫菜发酵制备耐高温超氧化歧化酶的方法，以及该耐高温超氧化歧化酶在化妆品中的应用。本专利技术具有发酵工艺简单，无需进行细胞破壁，产量高，且制备得到的SOD纯度高、耐高温、活性高，同时还具有保湿、抗皱、皮肤修复等多重护肤功效。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：15-20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至4.0-5.2，于80℃灭菌30min，降温至25-28℃，得条斑紫菜浆料；B、制备NB液体培养基：称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、葡萄糖20g，混合后加入1L的水，加热搅拌至均匀；冷却至室温，调节pH值至7.0-7.2，然后121℃灭菌15min，得NB液体培养基；C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，然后置于恒温培养摇床中，在30-37℃、120-150RPM条件下振荡培养24h；再按照体积比1:100接种于NB液体培养基中，在30-37℃、120-150RPM条件下振荡培养24-48h，得枯草芽孢杆菌种子液，期间测定其OD600，当所述种子液的OD600达到1.0后停止发酵；D、一次发酵：将步骤A所得的条斑紫菜浆料和步骤C所得的枯草芽孢杆菌种子液以质量比9：1的比例混合装入不锈钢发酵罐中进行发酵，发酵为期3天，期间温度保持在30-37℃的环境条件，且持续通入无菌空气，通气量为15-20L/min，发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；E、二次发酵：将步骤D得到的第一条斑紫菜发酵液装入10L光发酵罐中进行二次发酵，装液量为发酵罐容积的70-75%。先采用波长为254nm、功率为20-50W的紫外灯，辐照10-30min，然后使用60Co源进行γ辐照，辐照剂量为50-500Gy，辐照剂量率为15Gy/min，辐照10-30min，辐照过程中持续搅拌；辐照结束继续发酵36-48h，得第二条斑紫菜发酵液；整个发酵过程中，持续通入无菌空气，通气量为15-20L/min，罐中搅拌转速为50-100RPM，培养温度为30-37℃；发酵结束后，将所得第二条斑紫菜发酵液在8-12℃环境下静置15-60d，固液分离，收集液相组分，通过膜过滤机进行过滤，得第三条斑紫菜发酵液；F、SOD的分离提纯：将步骤E所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器，所述膜分离器的分离条件为：100kDa再生纤维素（RC）膜，50kDa的聚醚砜（PES）膜，50mM的磷酸钠缓冲溶液，搅拌速率900RPM，流速为13.3L/m2h；分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。所述耐高温超氧化歧化酶的活性大于5700U/mg，纯度大于96%，所述百分比为质量百分比。所述耐高温超氧化歧化酶在化妆品中的应用，可以作为活性物添加到化妆品中，起到清除自由基、抗氧化、抗衰老的作用。所述耐高温超氧化歧化酶在化妆水、护肤霜、护肤精华液中的使用，添加量优选为质量百分比0.05%-5%，更有选为3%。本专利技术在分离提纯过程中运用的膜分离器采用100kDa再生纤维素（RC）膜和50kDa的聚醚砜（PES）膜对耐高温超氧化歧化酶进行分离纯化。同时，本专利技术采用的膜分离器还可以连接AKTAPrimePlus蛋白液相系统（GEHealthcare,U.S.A.），膜分离器与蛋白液相系统中的置换泵相连，可以保证超滤过程中流速恒定。分离过程中，溶液pH值、溶液离子强度、跨膜压（TMP）及滤出液中的蛋白质情况，可由蛋白液相系统的pH计、电导率仪、压力传感器和紫外检测仪进行实时的在线监测。本专利技术在UV-γ辐照联用下发酵得到的条斑紫菜发酵液中SOD活性不低于7000U/mg，分离提纯后的耐高温超氧化歧化酶活性不低于5700U/mg，纯度不低于96%。制备所得耐高温超氧化歧化酶在80℃和90℃时酶活力稳定、无损失，在100℃放置30min后，酶活性剩余仍在63%以上，在pH4.0-8.0之间均表现稳定。综上所述，本专利技术采用的条斑紫菜在失水、高渗、强光和营养限制等逆境胁迫亦可以生长，说明该藻类的抗氧化酶体系在抵御外界逆境胁迫中发挥了重要的作用。通过微生物发酵制备的条斑紫菜发酵液，可制得高纯度、高活性、耐高温的超氧化歧化酶，且工艺简单，无需进行细胞破壁，生产成本低，可直接应用于化妆品，抗衰老功效显著。实验一：UV-γ辐照辐射对条斑紫菜发酵液中SOD活性的影响本专利技术按实施例1步骤（4）中所述的辐照条件，采用邻苯三酚自氧化法测定酶的活性，考察了紫外辐照和γ辐照对步骤（4）所得第三条斑紫菜发酵液耐高温超氧化歧化酶活性的影响。结果见图1、图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：/nA、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：15-20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至4.0-5.2，于80℃灭菌30 min，降温至25-28℃，得条斑紫菜浆料；/nB、制备NB液体培养基：称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖20 g，混合后加入1 L的水，加热搅拌至均匀；冷却至室温，调节pH值至7.0-7.2，然后121℃灭菌15 min，得NB液体培养基；/nC、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，然后置于恒温培养摇床中，在30-37℃、120-150 RPM条件下振荡培养24 h；再按照体积比1:100接种于NB液体培养基中，在30-37℃、120-150 RPM条件下振荡培养24-48h，得枯草芽孢杆菌种子液，期间测定其OD...

【技术特征摘要】
1.一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：
A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：15-20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至4.0-5.2，于80℃灭菌30min，降温至25-28℃，得条斑紫菜浆料；
B、制备NB液体培养基：称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、葡萄糖20g，混合后加入1L的水，加热搅拌至均匀；冷却至室温，调节pH值至7.0-7.2，然后121℃灭菌15min，得NB液体培养基；
C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，然后置于恒温培养摇床中，在30-37℃、120-150RPM条件下振荡培养24h；再按照体积比1:100接种于NB液体培养基中，在30-37℃、120-150RPM条件下振荡培养24-48h，得枯草芽孢杆菌种子液，期间测定其OD600，当所述种子液的OD600达到1.0后停止发酵；
D、一次发酵：将步骤A所得的条斑紫菜浆料和步骤C所得的枯草芽孢杆菌种子液以质量比9：1的比例混合装入不锈钢发酵罐中进行发酵，发酵为期3天，期间温度保持在30-37℃的环境条件，且持续通入无菌空气，通气量为15-20L/min，发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；
E、二次发酵：将步骤D得到的第一条斑紫菜发酵液装入10L光发酵罐中进行二次...

【专利技术属性】
技术研发人员：京逸如，岳娟，徐思伟，邱玉想，毕天宇，蒋丽刚，
申请(专利权)人：珀莱雅化妆品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33