本发明专利技术的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)阻断剂在制备治疗钙化性肌腱病药物中的应用，mTOR阻断剂为CHP‑PLGA‑RAPA纳米颗粒，该纳米颗粒可特异性结合病理性肌腱，并通过雷帕霉素调解肌腱干祖细胞的分化作用，可阻止肌腱损伤小鼠的肌腱和韧带等结缔组织中异位骨化进程。且在该应用中，CHP‑PLGA‑RAPA纳米颗粒表现出优异的病理胶原亲和力，控释能力和生物活性。
【技术实现步骤摘要】
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）阻断剂在制备治疗钙化性肌腱病药物中的应用
本专利技术属于肌腱相关疾病治疗药物
，尤其是涉及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)阻断剂在制备治疗钙化性肌腱病药物中的应用。
技术介绍
在有关肌肉骨骼系统疾病的临床咨询中，大约30％的患者是由于肌腱损伤。肌腱异位骨化症是肌腱病的一种亚型，会破坏肌腱组织本身的结构，加剧症状并严重削弱肌腱的活动功能。当前，并无针对肌腱钙化的特效治疗，依然以传统治疗为主，包括休息、物理治疗、口服镇痛药物、局部非甾体类抗炎药注射和保守治疗无效后的手术治疗。但是以上保守治疗效果欠佳，而手术存在较大的并发症发病率且疗效不稳定。主要的挑战是对骨化关键机制的了解不足，并且缺乏将药物精确地输送到病理肌腱的适当系统。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提出应用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)阻断剂作为制备治疗钙化性肌腱病药物，疗效显著。本专利技术公开了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)阻断剂在制备治疗钙化性肌腱病药物中的应用。其中，mTOR阻断剂为胶原蛋白杂交肽-聚(乳酸-乙醇酸)-雷帕霉素纳米颗粒，该纳米颗粒对应的英文缩写为CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒。其中，所述胶原蛋白杂交肽为市购产品，其具体结构为[(Gly-Pro-Hyp)6-Gly-Gly-Gly]2-Lys。其中，CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒制备过程包括如下步骤：(1)PLGA-RAPA纳米颗粒的制备：以乳化剂分子为稳定剂通过乳液-溶剂蒸发法制备而得；(2)CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒的制备：通过交联剂将胶原蛋白杂交肽共价缀合到PLGA-RAPA纳米颗粒上制备而得。其中，乳化剂为牛血清白蛋白(BSA)溶液；交联剂为戊二醛。其中，钙化性肌腱病为肌腱异位骨化症。本专利技术mTOR阻断剂为CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒，该纳米颗粒可特异性结合病理性肌腱，并通过雷帕霉素调解肌腱干祖细胞的分化作用，可阻止肌腱损伤小鼠的肌腱和韧带等结缔组织中异位骨化进程。且在该应用中，CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒表现出优异的病理胶原亲和力，控释能力和生物活性。附图说明图1为PLGA-RAPA纳米颗粒及CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒的表征图，其中，图1A为扫描电镜图；图1B为投射电镜图；图2为CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒与完整胶原蛋白(Intactcollagen)和受损胶原蛋白(Injuredcollagen)结合的投射电镜及扫描电镜图；图3肌腱异位骨化模型小鼠中胶原蛋白杂交肽-聚(乳酸-乙醇酸)纳米颗粒的病理性肌腱亲和力的体内评估；图4为异位骨化建模后，修复的小鼠跟腱在6周时micro-CT和组织学检查的表征图，其中图4A为Micro-CT成像图；图4B为组织学评估图，分别用HE，MASSON和SO染色。具体实施方式除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下面结合实施例来详细说明本专利技术。实施例1纳米粒子的制备及表征(1)PLGA-RAPA纳米颗粒的制备将聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA，Mw～78kD，中国济南岱罡生物科技有限公司)和雷帕霉素(RAPA，S1039，Selleck)均溶解在二氯甲烷中，浓度分别为20mg/ml和1mg/ml，得PLGA/RAPA溶液。将1mlPLGA/RAPA溶液迅速加入到4毫升磁力搅拌下的乳化剂牛血清白蛋白(BSA)溶液(3％)(Sigma-Aldrich)中。施加探针超声处理并在冰上以10W的功率进行30s的充分乳化。然后，搅拌至少3小时，直到凝固。收集PLGA-RAPA纳米颗粒，并通过以12,000rpm离心10分钟进行纯化，3次；然后将其重新悬浮在超纯水中，以去除多余的乳化剂溶液分子。(2)CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒的制备制备前，将肽加热(80℃；5分钟)，然后在冰上冷却1分钟以解开肽的螺旋结构。将PLGA-RAPA纳米颗粒(1mg/ml)的悬浮液与戊二醛(最终浓度为1mg/ml)在室温下轻轻摇动混合12小时。离心和超纯水洗涤后，再将胶原杂交肽[(Gly-Pro-Hyp)6-Gly-Gly-Gly]2-Lys添加到上述系统中，并进一步缀合，在室温下放置一周。在12,000rpm下离心10分钟，收集肽修饰的PLGA-RAPA，并在超声处理下用水洗涤3次以去除游离的肽分子，得到CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒。PLGA-RAPA纳米颗粒及CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒的扫描电镜及投射电镜结果如图1所示。实施例2CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒的结合特异性通过加热(80℃；5分钟)使1型胶原蛋白(猪的肌腱中提取)(0.5mg/ml)变性，然后置于冰浴中。在37℃的培养箱中2％胶原酶消化30分钟会损坏猪的肌腱。将10μl受伤的1型胶原蛋白或10μl完整的1型胶原蛋白固定到镍网上。1分钟后，用吸水纸将多余的溶液吸掉，然后加入10μl聚(乳酸-乙醇酸)或胶原蛋白杂交肽-聚(乳酸-乙醇酸)纳米颗粒(10nM)孵育组装好胶原的镍网10分钟，并用双蒸水洗涤3次。再将10μl2％(重量/体积)乙酸铀酰的染色溶液加到网格上，将样品染色，1分钟后，用吸水纸将多余的溶液吸掉。将上述镍网放置在室温下干燥过夜。最后，在投射电镜下观察。随后，将完整的肌腱和受伤的肌腱分别与CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒(10μM)在室温下的摇床上孵育2小时。之后，上述肌腱用PBS洗涤3次，并进一步进行扫描电镜处理。根据扫描电镜和投射电镜结果观察，CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒特异性附着在受损的胶原蛋白或腱上，而在完整的胶原蛋白或完整的肌腱中很少见，如图2所示。实施例3动物实验-体内荧光成像和分析建立肌腱异位骨化模型，将1型胶原酶(12.5U/腿，Gibco，17100017)注入8周龄小鼠右跟腱的中点，在PLGA-RAPA纳米颗粒或CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒的合成过程中，用Cy5(Lumiprobe，23020)代替RAPA，分别得到PLGA-Cy5或CHP-PLGA-Cy5。肌腱异位骨化建模后一周，给小鼠注射PLGA-Cy5或CHP-PLGA-Cy5。用异氟烷麻醉小鼠，并在指定的时间点通过荧光成像系统(IVISSpectrumCT，PerkinElmer)进行分析。图3为上述纳米颗粒注射入损伤的跟腱后的小鼠活体荧光成像图，及在不同时间点PLGA-Cy5或CHP-PLGA-Cy5的总辐射效率。结果显示，与PLGA-Cy5相比，CHP-PLGA-Cy5在各个时间点均显著增强了Cy5在肌腱组织中的保留，表明前者对受损的肌腱具有更强的亲和力，并且是更有效的药物递送载体。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)阻断剂在制备治疗钙化性肌腱病药物中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)阻断剂在制备治疗钙化性肌腱病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，mTOR阻断剂为胶原蛋白杂交肽-聚(乳酸-乙醇酸)-雷帕霉素纳米颗粒(CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒)。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胶原蛋白杂交肽的结构为[(Gly-Pro-Hyp)6-Gly-Gly-Gly]2-Lys。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，CHP-PLGA-RAPA纳米颗粒制备过程包括如...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓，毛铮伟，陈扬武，陈小怡，茵梓，沈炜亮，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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