用于检测大豆植物DBN8002的核酸序列及其检测方法技术

一种用于检测大豆植物DBN8002的核酸序列及其检测方法，所述核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。大豆植物DBN8002对鳞翅目昆虫具有较好的抗性并对草铵膦除草剂具有较好的耐受性，对产量无影响，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因大豆事件DBN8002的DNA分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测大豆植物DBN8002的核酸序列及其检测方法
本专利技术涉及植物分子生物学领域，特别是农业生物技术研究中的转基因农作物育种领域。具体地，本专利技术涉及昆虫抗性和草铵膦除草剂耐受性的转基因大豆事件DBN8002和用于检测生物样品中是否包含特定转基因大豆事件DBN8002的核酸序列及其检测方法。
技术介绍
大豆(Glycinemax)是世界五大主栽作物之一。生物技术已经应用于大豆以改善其农艺性状和品质。在大豆生产中除草剂耐受性是一项重要的农艺性状，特别是耐受草甘膦除草剂，如已有成功的大豆事件GTS40-3-2、MON89788，美国等大豆主要种植区域已广泛种植。另一个重要的农艺性状是昆虫抗性，特别是对鳞翅目昆虫的抗性，如已有成功的大豆事件MON87701在巴西等大豆主要种植区域广泛种植。值得一提的是，Vip蛋白与Cry蛋白的作用机制不同，其为营养期杀虫蛋白，且可以作为一种有效管理Cry蛋白抗性昆虫的手段。大豆对鳞翅目昆虫的抗性可以通过转基因的方法使鳞翅目昆虫的抗性基因在大豆植物中表达而获得。此外，草铵膦除草剂与草甘膦除草剂的作用机理不同，其为灭生性的触杀型除草剂，且可以作为一种有效管理草甘膦抗性杂草的手段。大豆对草铵膦除草剂的耐受性可以通过转基因的方法使草铵膦除草剂耐受型基因(如PAT)在大豆植物中表达而获得。设计适用于转化大豆作物的包含外源功能基因(Vip3Aa基因和PAT基因)的表达载体且得到相应的可商业化转基因大豆事件具有重要意义。目前未有Vip蛋白在大豆植物控虫上成功应用的案例，与此同时，除草剂耐受性作为大豆生产中一项重要的农艺性状，几乎是不可或缺的，因此良好的商业化大豆转化事件要综合考虑Vip3Aa基因和PAT基因在大豆植物中的载体设计、两个表达盒的互作影响、抗虫效果、耐受除草剂效果以及对产量和其他植物生理指标的影响，使得Vip3Aa基因和PAT基因能够在大豆中适量表达并实现其相应的功能，而不影响大豆产量和其他生理指标。已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好的适应当地的生长条件。能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含于插入序列的第一引物和包含于插入序列的第二引物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测大豆植物DBN8002的核酸序列及其检测方法，转基因大豆事件DBN8002对昆虫具有较好的抗性并对草铵膦除草剂具有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因大豆事件DBN8002的DNA分子。为实现上述目的，本专利技术提供了一种核酸序列，具有SEQIDNO：3或其互补序列第1-642位中至少11个连续的核苷酸和SEQIDNO：3或其互补序列第643-1524位中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQIDNO：4或其互补序列第1-347位中至少11个连续的核苷酸和SEQIDNO：4或其互补序列第348-656位中至少11个连续的核苷酸。优选地，所述核酸序列具有SEQIDNO：3或其互补序列第1-642位中22-25个连续的核苷酸和SEQIDNO：3或其互补序列第643-1524位中22-25个连续的核苷酸、和/或SEQIDNO：4或其互补序列第1-347位中22-25个连续的核苷酸和SEQIDNO：4或其互补序列第348-656位中22-25个连续的核苷酸。优选地，所述核酸序列包含SEQIDNO：1或其互补序列、和/或SEQIDNO：2或其互补序列。所述SEQIDNO：1或其互补序列为转基因大豆事件DBN8002中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQIDNO：1或其互补序列跨越了大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5’末端的DNA序列，包含所述SEQIDNO：1或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件DBN8002的存在。所述SEQIDNO：2或其互补序列为转基因大豆事件DBN8002中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQIDNO：2或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的DNA序列和大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQIDNO：2或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件DBN8002的存在。优选地，所述核酸序列包含SEQIDNO：3或其互补序列、和/或SEQIDNO：4或其互补序列。本专利技术中，所述核酸序列可以为所述SEQIDNO：3或其互补序列中T-DNA插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述SEQIDNO：3或其互补序列中5’侧翼大豆基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQIDNO：1的所述SEQIDNO：3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列可作为DNA引物对用于产生扩增产物的DNA扩增方法中。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQIDNO：1的扩增产物时，可以诊断转基因大豆事件DBN8002或其后代的存在。所述SEQIDNO：3或其互补序列为转基因大豆事件DBN8002中在T-DNA插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1524个核苷酸的序列，所述SEQIDNO：3或其互补序列由642个核苷酸的大豆基因组5’侧翼序列(SEQIDNO：3的核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸序列，其特征在于，具有SEQ ID NO：3或其互补序列第1-642位中至少11个连续的核苷酸和SEQ ID NO：3或其互补序列第643-1524位中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO：4或其互补序列第1-347位中至少11个连续的核苷酸和SEQ ID NO：4或其互补序列第348-656位中至少11个连续的核苷酸；/n优选地，所述核酸序列具有SEQ ID NO：3或其互补序列第1-642位中22-25个连续的核苷酸和SEQ ID NO：3或其互补序列第643-1524位中22-25个连续的核苷酸、和/或SEQ IDNO：4或其互补序列第1-347位中22-25个连续的核苷酸和SEQ ID NO：4或其互补序列第348-656位中22-25个连续的核苷酸；/n优选地，所述核酸序列包含SEQ ID NO：1或其互补序列、和/或SEQ ID NO：2或其互补序列；/n优选地，所述核酸序列包含SEQ ID NO：3或其互补序列、和/或SEQ ID NO：4或其互补序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸序列，其特征在于，具有SEQIDNO：3或其互补序列第1-642位中至少11个连续的核苷酸和SEQIDNO：3或其互补序列第643-1524位中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQIDNO：4或其互补序列第1-347位中至少11个连续的核苷酸和SEQIDNO：4或其互补序列第348-656位中至少11个连续的核苷酸；
优选地，所述核酸序列具有SEQIDNO：3或其互补序列第1-642位中22-25个连续的核苷酸和SEQIDNO：3或其互补序列第643-1524位中22-25个连续的核苷酸、和/或SEQIDNO：4或其互补序列第1-347位中22-25个连续的核苷酸和SEQIDNO：4或其互补序列第348-656位中22-25个连续的核苷酸；
优选地，所述核酸序列包含SEQIDNO：1或其互补序列、和/或SEQIDNO：2或其互补序列；
优选地，所述核酸序列包含SEQIDNO：3或其互补序列、和/或SEQIDNO：4或其互补序列。


2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包含SEQIDNO：5或其互补序列。


3.一种检测样品中转基因大豆事件DBN8002的DNA存在的方法，其特征在于，包括：
使待检测样品与用于扩增目标扩增产物的至少两种引物在核酸扩增反应中接触；
进行核酸扩增反应；和
检测所述目标扩增产物的存在；
所述目标扩增产物包含权利要求1或2所述核酸序列；优选地，所述目标扩增产物包含SEQIDNO：1或其互补序列、SEQIDNO：2或其互补序列、SEQIDNO：6或其互补序列、和/或SEQIDNO：7或其互补序列。


4.根据权利要求3所述检测样品中转基因大豆事件DBN8002的DNA存在的方法，其特征在于，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：8和SEQIDNO：10；所述第二引物选自SEQIDNO：2、SEQIDNO：9和SEQIDNO：11。


5.一种检测样品中转基因大豆事件DBN8002的DNA存在的方法，其特征在于，包括：
使待检测样品与探针接触，所述探针包含权利要求1所述核酸序列；优选地，所述探针包含SEQIDNO：1或其互补序列、SEQIDNO：2或其互补序列、SEQIDNO：6或其互补序列、和/或SEQIDNO：7或其互补序列；
使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；和
检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。


6.根据权利要求5所述检测样品中转基因大豆事件DBN8002的DNA存在的方法，其特征在于，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。


7.一种检测样品中转基因大豆事件DBN8002的DNA存在的方法，其特征在于，包括：
使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包括权利要求1所述核酸序列；优选地，所述标记物核酸分子包括选自以下的至少一种：SEQIDNO：1或其互补序列、SEQIDNO：2或其互补序列、和/或SEQIDNO：6-11或其互补序列；
使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；
检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物辅助育种分析以确定昆虫抗性和/或除草剂耐受性与标记物核酸分子在遗传学上是连锁的。


8.一种DNA检测试剂盒，其特征在于，包括至少一个DNA分子，所述DNA分子包含权利要求1所述核酸序列，其可以作为对于转基因大豆事件DBN8002或其后代具有特异性的DNA引物之一或探针；优选地，所述DNA分子包含SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩超，于彩虹，谢香庭，王登元，杨淑靖，崔广东，康越景，鲍晓明，
申请(专利权)人：北京大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11