一种与辣椒反向温敏不育基因连锁的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与辣椒反向温敏核不育基因连锁的分子标记及应用。利用野生型与突变型辣椒材料构建了F

【技术实现步骤摘要】
一种与辣椒反向温敏不育基因连锁的分子标记及应用
本专利技术属于辣椒育种分子生物学领域，涉及辣椒(CapsicumannuumL)温敏不育基因连锁的分子标记及该分子标记在辣椒温敏不育鉴定和育种中的应用。
技术介绍
植物雄性不育在杂种优势利用上具有重要作用，已广泛应用于水稻、小麦、玉米、油菜、棉花等农作物商业杂交种生产中，其中温敏不育是雄性不育重要类型之一，以温敏雄性不育系为基础的两系法育种具有明显优势，其不受恢、保关系制约，配组自由一系两用，生产程序简单，无细胞质负效应和细胞质单一带来的潜在风险。目前应用最广的为正向温敏雄性不育系，在水稻中已发现64S、NorinPL12、TGMS-VN和5460S等10多个正向温敏雄性不育系。如水稻温敏雄性不育系64S的不育临界温度23.3℃，可以在较低温度条件下自繁，在较高温度条件下制种。棉花、玉米、小麦、大麦、油菜、大豆、高粱等作物正向温敏雄性不育系也相继被发现，如棉花的TMS-2温敏雄性不育系(27～28℃)，玉米的琼6Qms温敏雄性不育系(31℃)等。反向温敏雄性不育系育性上与正向温敏雄性不育系相反，表现为高温可育低温不育特性。反向温敏雄性不育系可在高温条件下自繁，在较高纬度或较高海拔地区及低纬较低温度条件下制种。目前水稻反向温敏雄性不育系主要有滇农S-2、昆植S-1、衡S-3、IVA、go543S、J207S、宜DIS、G20S以及通过物理诱变获得的反向温敏雄性不育系FHS。研究发现反向温敏雄性不育系go543S育性转换温度为28～30.5℃，育性仅受温度调控，即高于30.5℃可育，低温28℃不育。反向温敏雄性不育系FHS育性转换温度为25～26℃(王会峰，2005)。在小麦中，ES系列、C49S和C86S系列、YM3314、A3017和337S等反向温敏雄性不育系育性特点也相继被报道。反向温敏雄性不育系的发现与选育为两系杂交育种及杂种优势利用拓展了新的应用空间。辣椒(CapsicumannuumL.)茄科、辣椒属一年或有限多年生草本植物。近年来我国辣椒年播种面积在150万～200万hm2，目前已经占全国蔬菜总播种面积的8％～10％。目前尚未有关于辣椒反向温敏核不育的相关报道，因此辣椒温敏不育突变体作为一种重要的种质资源，将会深受未来育种家们的青睐。通过开发与辣椒反向温敏不育基因连锁的分子标记，采用杂交和回交等技术快速的将温敏不育基因与其他优良性状基因导入到植株中，为选育高质量的新品种提供基因资源。开发与反向温敏不育基因连锁的分子标记，有利于辣椒温敏雄性不育的选育，且为克隆辣椒反向温敏不育基因，研究反向温敏不育的分子机制奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于针对辣椒花蕾发育中出现的雄性温敏不育现象(28℃及以上表现为可育，28℃以下表现为不育)，提供一种与辣椒反向温敏不育基因连锁的分子标记Pe_K_1200003(辣椒全基因组Chr12：12,852,132bp处的G变A)。为辣椒温敏不育突变体的筛选，鉴定和辅助筛选辣椒温敏不育性状，以及辣椒雄性温敏不育的育种等提供新的途径。所述的分子标记对应的基因型包括：G:G和A:G为具有花粉活力的可育基因型、A:A为不具有花粉活力的不育基因型。本专利技术所述的具有花粉活力表现在具有花粉、且花粉有充分的可育活力(28℃及以上)，不具有花粉活力表现在完全无花粉，或者有极少量花粉，且花粉无可育活力(28℃以下)。针对上述辣椒反向温敏不育突变设计的引物包括两条正向引物和一条反向引物，正向引物X：AAAATATCAAACCAATTCCAACTAG，见SEQIDNo.1所示；正向引物Y：AAAATATCAAACCAATTCCAACTAA，见SEQIDNo.2所示。两条正向引物分别连接不同的荧光接头序列(LGC公司的FAM或HEX接头序列)优选：FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，见SEQIDNo.3所示；HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，见SEQIDNo.4所示。分别连接不同的荧光接头序列后的引物序列如下：正向引物Pe_K_1200003X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAAATATCAAACCAATTCCAACTAG，见SEQIDNo.5所示；正向引物Pe_K_1200003Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAAATATCAAACCAATTCCAACTAA，见SEQIDNo.6所示；反向引物Pe_K_1200003C：TCACATGTTAGAAATTGTTTGTCA，见SEQIDNo.7所示；本专利技术的第二个目的是提供上述分子标记的应用，有利于辣椒花粉育性的选育，且为克隆温敏不育，研究温敏不育的分子机制奠定基础。具体包括：用于鉴定和辅助筛选辣椒育性。进一步的，用于辣椒温敏不育鉴定、筛选或者育种。上述分子标记应用时，采用PCR反应进行检测。分子标记应用时，具体包括以下步骤：(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行扩增，获得扩增产物；(2)对扩增产物进行检测与分析。对扩增产物进行荧光检测时，如果样品PCR产物只检测到引物Pe_K_1200003X对应的荧光信号，则检测位点为G:G基因型，判定为辣椒具有花粉活力表型的单株；如果样品PCR产物只检测到引物Pe_K_1200003Y对应的荧光信号，则检测位点为A:A基因型，判定为辣椒花粉不育表型的单株；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为A:G基因型，判定为辣椒具有花粉活力表型的单株。分子标记应用时，采用TouchdownPCR，扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。本专利技术利用BSA定位的方法，定位到一个新的控制辣椒花粉发育的SNP变异，并依据该基因的突变位点，开发了与该辣椒花粉发育基因相关联的KASP分子标记。可以直接用于辣椒花粉育性和相对应的基因型的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，能够有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响的问题。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到满意的植株，有效的减小了种植规模，减少了后期鉴定的工作量。提高了选择的效率和准确性。可以用于各种品种的辣椒鉴定，对研究反向温敏不育的形成机制具有重大的意义。因此，本专利技术在辣椒雄性温敏不育育种实践及温敏不育理论研究上均具有重要意义。附图说明图1为本专利技术的Pe_K_1200003分子标记在野生型(WT)与突变型(MT)构建的F2群体中进行基因分型的部分结果；A处表示：PCR产物为引物Pe_K_1200003Y对应的荧光信号，为不育的纯合单株；B处表示：PCR产物为引物Pe_K_1200003X对应的荧光信号，为可育的纯合单株；C处表示：PCR产物具有引物Pe_K_1200003X、Y两种对应的荧光信号，为可育的杂合单株。...

【技术保护点】
1.一种与辣椒反向温敏不育基因连锁的分子标记，其特征在于：为辣椒Chr12：12,852,132bp处G向A的突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种与辣椒反向温敏不育基因连锁的分子标记，其特征在于：为辣椒Chr12：12,852,132bp处G向A的突变。


2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的分子标记对应的基因型包括：G:G为具有花粉活力的基因型，A:G为具有花粉活力的基因型；A:A为不具有花粉活力的基因型。


3.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，针对辣椒反向温敏不育突变设计的引物包括两条正向引物和一条反向引物，
正向引物X：AAAATATCAAACCAATTCCAACTAG；
正向引物Y：AAAATATCAAACCAATTCCAACTAA。


4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，其特征在于：两条正向引物分别连接不同的荧光接头序列；
优选：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。


5.权利要求1-4任一项所述的分子标记的应用，其特征在于，用于鉴定和辅助筛选辣...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘峰，谢玲玲，冯文鹏，周书栋，郑井元，杨莎，马艳青，戴雄泽，邹学校，
申请(专利权)人：湖南省蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43