【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于辣椒育种和分子生物学领域，尤其涉及一种检测辣椒成熟果实颜色的snp分子标记的应用、其特异性引物及获得方法。
技术介绍
1、辣椒作为一种重要的蔬菜作物、辛辣调味料和食品添加剂，在全世界广泛种植。我国辣椒年种植面积已达210万公顷，农业总产量6400多万吨，种植面积和消费量均居蔬菜第一。果色是辣椒最直观的商品性状，漂亮的色泽能吸引更多消费者的关注，提升辣椒产品的市场竞争力。丰富辣椒果实色泽资源，选育不同果色辣椒一直受到育种家的重视。虽然目前市场上仍以选育红色辣椒为主，但橙色、黄色等能满足加工专用型剁椒、酱椒的辣椒品种的需求也逐渐增多，市场不断增大。从橙色、黄色辣椒中提取的辣椒橙色素是重要食品添加剂之一，选育高橙色素含量辣椒品种也有助于我国辣椒橙色素加工产业发展。由于我国以选育红辣椒为主，橙色辣椒资源并不多，而传统杂交育种周期长、工作量大、表型易受环境条件影响，橙果优良品种短时间内选育出来难度仍较大。因此有必要开展辣椒果实颜色遗传及分子机理的研究，开发果实橙色性状分子标记辅助育种技术，加快辣椒橙果新品种的选育速度，以满足广大市场的需求。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是传统杂交育种周期长、工作量大、表型易受环境条件影响，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种用于检测辣椒成熟果实颜色的snp分子标记的应用、其特异性引物及获得方法。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：
3、一种用于检测辣椒成熟果实颜色的snp分子标
4、本专利技术的第一个目的在于提供一种用于检测辣椒成熟果实颜色的snp分子标记应用，此处碱基突变位点位于capana06g000951启动子区域，具体如图1所示。该snp分子标记能够用于辣椒成熟果实颜色的鉴定，该标记能够准确在苗期准确的区分出辣椒成熟果实颜色，可为高效选育橙色辣椒新品种提供辅助，同时还能够为克隆snp位点所在基因及解析辣椒果实类胡萝卜素合成与代谢分子调控机制奠定基础。
5、优选的，所述辣椒参考基因组为2.0cv.zunla-1。
6、优选的，所述应用方法，具体包括以下步骤：
7、(1)提取待检测辣椒dna模板；
8、(2)基于snp分子标记位点设计引物，进行pcr扩增；
9、(3)检测pcr扩增产物，利用凝胶成像系统读取带型；
10、(4)切胶，利用dna回收试剂盒回收目的片段；
11、(5)对回收的目的片段直接测序，分析碱基序列，当辣椒6号染色体16789920位碱基为g时，辣椒成熟果实表现为红色，碱基为a时辣椒成熟果实表现为橙色。
12、优选的，步骤(2)所述pcr扩增体系为：总体积为40-50μl，其中，模板dna0.5-1μl，10μm forward primer 0.5-1μl，10μm reverse primer 0.5-1μl，2×easytaq pcrsupermix 20-25μl,nuclease-free water 18-21μl。
13、优选的，步骤(2)所述pcr扩增步骤具体为：94℃下预变性3-5min；94℃下变性20-30s，退火温度为40-47℃，持续20-30s，延伸温度为65-72℃，持续30s，35-40个循环；然后在72℃下进行最终延伸5-10min；反应终止。
14、优选的，步骤(3)检测pcr扩增产物采用1-5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
15、在同一个技术构思下，本专利技术还提供一种用于检测辣椒成熟果实颜色的snp分子标记的特异性引物，所述引物序列如下所示：
16、正向引物f：5’-ctacttgtttatgtatagga-3’；
17、反向引物r：5’-cagaagggacacgtc-3’。
18、在同一个技术构思下，本专利技术还提供一种用于检测辣椒成熟果实颜色的snp分子标记的获得方法，包括以下步骤：
19、(1)以辣椒高代自交系6421与果色突变体e55为父、母本，构建f2群体；所述辣椒高代自交系6421的序列如seq id no.1所示，所述果色突变体e55的序列如seq id no.2所示；
20、(2)单株种植f2群体，植株果实成熟后等量选取红果与橙果单株，按单株分别提取叶片dna，等量混合红果单株dna样品和橙果单株dna样品，分别构建红果混池和橙果混池，将两个混池在illumina hi-seq 2500平台上测序，测序深度20×；
21、(3)利用mutmap技术对辣椒果实橙色突变基因进行初步定位，以1m为窗口大小，每次滑动10kb，对辣椒1-12号染色体中的snp划分为1000份，并对ed值取4的幂次方进行局部线性回归拟合，阈值线设定为拟合值标准差的3倍加上拟合值的中位数值，筛选候选染色体区域，对目标区段的snp/indel进行注释，筛选候选基因及snp分子标记；
22、(4)根据候选snp设计引物在f2扩大群体中检测表型与基因型共分离程度，进一步验证候选snp的正确性，最终确定snp分子标记位点。
23、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
24、(1)辣椒橙果突变体e55通过ems(甲基磺酸乙酯)诱变获得，能稳定遗传的橙色果实性状，除果实颜色与6421不同外，突变株其它农艺特征与6421无显著差异。e55果实橙色性状受一对隐性基因的控制。本专利技术在此基础上，分别以6421和果色突变体e55为父母本，构建野生型和突变体f2子代混池，采用mutmap初步定位橙果突变候选基因，并开发snp分子标记，并将开发的snp分子标记在f2扩大群体中检测表型与基因型共分离程度，进一步验证候选snp的正确性。研究结果提供了一种新型的辣椒果实颜色的分子鉴定方法，有利于加快辣椒果色育种进程；
25、(2)本专利技术的分子标记应用能够在苗期对材料的成熟果实颜色进行鉴定，快速且准确的选出纯合基因型，不受环境与其他外界因素影响；
26、(3)本专利技术的分子标记应用有利于橙色辣椒新品种的高效选育，缩短育种周期，减少田间材料种植的工作量，节省人力物力；
27、(4)利用本专利技术的snp分子标记，能够为克隆辣椒橙色果实基因提供基础，同时为后续解析辣椒果实类胡萝卜素合成与代谢分子调控机理奠定基础。
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1.一种用于检测辣椒成熟果实颜色的SNP分子标记的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位点位于辣椒6号染色体16789920位碱基处，此处碱基为G的辣椒成熟果实表现为红色，此处碱基为A的辣椒成熟果实表现为橙色。
2.如权利要求1所述的检测辣椒成熟果实颜色的SNP分子标记的应用，其特征在于，所述辣椒参考基因组为2.0cv.Zunla-1。
3.如权利要求1所述的检测辣椒成熟果实颜色的SNP分子标记的应用，其特征在于，所述应用方法，具体包括以下步骤：
4.如权利要求1所述的检测辣椒成熟果实颜色的SNP分子标记的应用，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增体系为：总体积为40-50μL，其中，模板DNA0.5-1μL，10μM ForwardPrimer 0.5-1μL，10μM Reverse Primer 0.5-1μL，2×EasyTaq PCR SuperMix20-25μL,Nuclease-free Water 18-21μL。
5.如权利要求1所述的检测辣椒成熟果实颜色的SNP分子标记的应用，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩
6.如权利要求1所述的检测辣椒成熟果实颜色的SNP分子标记的应用，其特征在于，步骤(3)检测PCR扩增产物采用1-5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
7.一种用于检测辣椒成熟果实颜色的SNP分子标记的特异性引物，其特征在于，所述引物序列如下所示：
8.一种如权利要求1-6任一项所述的用于检测辣椒成熟果实颜色的SNP分子标记的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测辣椒成熟果实颜色的snp分子标记的应用，其特征在于，所述snp分子标记位点位于辣椒6号染色体16789920位碱基处，此处碱基为g的辣椒成熟果实表现为红色，此处碱基为a的辣椒成熟果实表现为橙色。
2.如权利要求1所述的检测辣椒成熟果实颜色的snp分子标记的应用，其特征在于，所述辣椒参考基因组为2.0cv.zunla-1。
3.如权利要求1所述的检测辣椒成熟果实颜色的snp分子标记的应用，其特征在于，所述应用方法，具体包括以下步骤：
4.如权利要求1所述的检测辣椒成熟果实颜色的snp分子标记的应用，其特征在于，步骤(2)所述pcr扩增体系为：总体积为40-50μl，其中，模板dna0.5-1μl，10μm forwardprimer 0.5-1μl，10μm reverse primer 0.5-1μl，2×easytaq pcr super...
【专利技术属性】
技术研发人员：周书栋，杨博智，于会洋，刘周斌，吴丽丽，索欢，李雪峰，
申请(专利权)人：湖南省蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：
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