【技术实现步骤摘要】
槟榔芋软腐病病害的生防真菌鉴定方法
本专利技术涉及生物防治
，具体为槟榔芋软腐病病害的生防真菌鉴定方法。
技术介绍
槟榔芋是天南星科芋属植物，它的株高1.3m左右，每株有母芋和小芋，生长旺盛，块茎呈圆柱或椭圆形，剖开芋肉呈现槟榔花纹，乳白色中略带紫红色花纹，经烹饪后香味浓郁且口感松软，故又称之为香芋，槟榔芋营养价值高，富含蛋白质、淀粉、矿物质和多种维生素等物质，具有益脾胃和补气养肾等功效，因是日常烹饪美食的上乘原料，又兼有滋补作用而市场需求广阔。软腐病是槟榔芋病害中最为主要的一种，近年来在农业生产上造成的危害日益严重，株发病率一般为3％～15％，严重时超过50％甚至绝收，槟榔芋软腐病发病多体现在槟榔芋的叶柄基部或地下球茎，叶柄基部染病初期有不明显病斑，颜色变化为暗绿色，有水渍出现，后期为叶柄内的腐烂和颜色加深变褐，叶片卷曲发黄；地下球茎染病导致球茎内部逐渐软化腐烂并散发难闻臭味，发病迅速最终导致整株枯萎倒伏，病菌侵入将在寄主植株内部迅速繁殖，对槟榔芋的生长具毁灭性的伤害。软腐病病原菌为细菌，病残组织携带病菌于土...
【技术保护点】
1.槟榔芋软腐病病害的生防真菌鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1.试验材料准备/n材料：土样和健康槟榔芋球茎均采自福建省福鼎市贯岭镇河坑村槟榔芋种植田地，选取不同种植地块，其中土样取深度10～15cm的健康槟榔芋植株根际土壤3处各200g，健康槟榔芋球茎5棵，标记后放入装有冰袋的保温箱中带回备用。槟榔芋软腐病病原细菌来源于实验室前期分离鉴定菌株。/nS2.真菌的分离纯化/n土壤分离真菌：称取10g土壤放入盛有90mL无菌水并有玻璃珠三角瓶中，振荡10min，依次稀释成10
【技术特征摘要】
1.槟榔芋软腐病病害的生防真菌鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.试验材料准备
材料：土样和健康槟榔芋球茎均采自福建省福鼎市贯岭镇河坑村槟榔芋种植田地，选取不同种植地块，其中土样取深度10～15cm的健康槟榔芋植株根际土壤3处各200g，健康槟榔芋球茎5棵，标记后放入装有冰袋的保温箱中带回备用。槟榔芋软腐病病原细菌来源于实验室前期分离鉴定菌株。
S2.真菌的分离纯化
土壤分离真菌：称取10g土壤放入盛有90mL无菌水并有玻璃珠三角瓶中，振荡10min，依次稀释成10-1-10-8的稀释液。分别吸取上述稀释液100μL均匀涂于PDA培养基平板上，设三次重复，于28℃恒温箱倒置培养3～5d，每天观察生长情况。
内生菌分离真菌：将健康的槟榔芋球茎洗净后切取成5×5×5cm组织块，75％乙醇浸泡1min，无菌水漂洗，0.1％升汞表面消毒1～2min，无菌水冲洗3次晾干。用无菌刀将消毒后的组织块切成约0.5×0.5×0.5cm的小块，置于有无菌水研钵中研磨成浆，静置10min，将研磨液梯度稀释10～1000倍，分别取100μL涂布到PDA培养基平板上，设三次重复，于28℃恒温箱倒置培养3～5d，每天观察生长情况。
上述方法待长出菌落后，根据菌落形态、颜色等性状将不同的单菌落挑出，采用平板划线法在PDA培养基上进行分离纯化2～3次，直至分离出单菌落，于斜面试管4℃保藏。
S3.离体块茎回接筛选试验
1)槟榔芋组织块材料准备：选取健康槟榔芋球茎，洗净并风干后，切取大小为长3cm×3cm×0.7cm的组织块，75％乙醇消毒30s，0.1％升汞液消毒5min，无菌水充分涤荡5次，再放入有滤纸的无菌培养皿中，备用；
2)菌液的培养：将分离纯化出的生防真菌和软腐病病原细菌分别接种于PDA、NA液体培养基中，真菌于28℃、220r·min-1摇床培养3d，病原细菌于37℃、220r·min-1摇床培养8h，备用；
3)离体回接试验：将软腐病病原菌液和待测真菌液以1﹕1混合，用无菌刀和镊子在处理的组织块中央划长1cm、宽1cm、深约0.3cm的十字伤口，接种20μL混合菌液于组织块十字中央。以无菌水接种为阴性对照，软腐病病原菌液接种为阳性对照，设三次重复，置于28℃恒温培养箱培养14d，观察记录；
S4.菌种分子鉴定
用真菌DNA提取试剂盒提取菌株DNA进行PCR扩增，PCR扩增用真菌通用引物。PCR产物委托公司测序，根据测序所得序列经过序列比对筛选出重复菌株，得到独立不重复菌株后构建进化树，确定菌种；
S5.菌株的形态观察
利用插片法培养真菌，将1/3无菌盖片45°插入平板培养基中，于盖片和培养基交界处接菌，28℃恒温培养5d，用棉兰染液染色，对菌落的形态、颜色、质地、边缘特征等进行平板和显微镜观察。
S6.菌株的生长特性筛选
1)菌饼准备：配制PDA培养基，接种真菌至凝固...
【专利技术属性】
技术研发人员：董晓菲，叶祖云，周银珠，陈美霞，刘盛荣，
申请(专利权)人：宁德师范学院，
类型：发明
国别省市：福建;35
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