本发明专利技术属于食品检测领域，具体涉及吲哚‑3‑乙酸甲酯在鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中的应用。本发明专利技术首次提出以内源性小分子非挥发性物质吲哚‑3‑乙酸甲酯作为中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜鉴别的特征标志物，并确定了中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中吲哚‑3‑乙酸甲酯的含量范围。同时，本发明专利技术进一步提供了中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别方法，该方法定量准确，稳定性强，便于操作和推广，对于准确识别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜有着重要意义，有利于促进蜂产品产业化发展，有利于养蜂行业健康和可持续发展。
【技术实现步骤摘要】
吲哚-3-乙酸甲酯在鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中的应用
本专利技术涉及食品检测领域，具体涉及吲哚-3-乙酸甲酯在鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中的应用。
技术介绍
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。来源于不同的蜜蜂种类、蜜源植物、产地、甚至采收和加工方法的差异均可导致蜂蜜中内源性活性组分的不同。意大利蜜蜂和中华蜜蜂是我国饲养的两个主要蜜蜂品种，目前我国有900万左右的蜂群，其中意大利蜜蜂为800万群，中华蜜蜂的蜂群数量在100万群左右。意蜂蜂蜜是从国外引进的意大利蜜蜂采集并酿造而成的，意蜂易饲养，繁殖快，蜂蜜产量高，能采集大面积蜜源。但是通常意蜂蜂蜜生产周期短,含水量大,夏季易发酸起沫变质,通常需要经过后期的加工程序才可食用。中华蜜蜂作为中国特有蜜蜂品种，其生产的蜂蜜深受国人喜爱，与意大利蜜蜂相比，春季采蜜时间早，秋季停止采蜜时间晚，行动敏捷，适应性强，而且能采集面积小的蜜源，适合山区饲养。所以中华蜜蜂多采集森林或山区的杂花花蜜充分酿制而成蜂蜜。由于其蜜色泽深、口味独特、香甜味浓，含有多种能被人体直接吸收的微量元素，由于酿蜜周期长、蜜源稀少被誉为“蜜之珍品”。由于中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜在生产方式和品质上的差异，导致二者在价格上存在明显差异，所以一些不法分子为了追求高额利润用意蜂蜂蜜冒充或掺入中蜂蜂蜜中以次充好，给广大的中蜂蜂农和相关的企业造成了严重的经济损失，同时也制约了中蜂产业的健康发展。近年来中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜鉴别技术的开发受到科研人员和相关蜂产品企业的广泛关注，中国专利申请201610545277.1，专利201510999246.9和201910550683.0均报道了中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的识别技术，以上所述技术均依赖于蛋白质作为特征生物标志物进行鉴别，但是需要复杂的蛋白质提取、浓度测定、蛋白质电泳分离和条带识别等复杂的样品前处理过程和复杂的MALDI-TOF-TOF技术，不符合高效快速鉴别的发展趋势。中国专利申请20180008004.2报道了基于蜂蜡烷烃进行中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜鉴别的方法，但作为挥发性成分会随储存时间的延长，其含量明显下降。因此建立快速，准确且稳定鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的化学分析方法是十分必要的。近年来，小分子内源性物质凭借在基质中稳定存在，且提取测定简便，被广泛应用于食品真实性和溯源鉴别，但在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜鉴别中尚无相关报道。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术通过液相色谱串联高分辨质谱分别对大量的中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜样品进行正模式全扫描分析，获得样品谱图，对比不同中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的谱图时发现，它们均存在稳定的特征差异区域，通过该特征差异区域一级二级质谱碎片(特征区域的一级二级质谱图分别见图2、图3)，鉴定该物质为吲哚-3-乙酸甲酯(其化学结构参见图7)。之后，本专利技术基于液相色谱串联质谱(LC-QQQ)建立特征标志物定量分析方法，对大量真实样品进行检测，确定了中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中吲哚-3-乙酸甲酯各自的阈值范围，从而提出了一种新的根据内源性小分子物质鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法。为了实现上述目的，本专利技术首先提出了吲哚-3-乙酸甲酯在鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中的应用。本专利技术发现吲哚-3-乙酸甲酯在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中的含量相对稳定，且含量差异明显，可作为鉴别上述两种蜂蜜的依据。本专利技术进一步提出一种中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别方法，以吲哚-3-乙酸甲酯的含量为鉴别依据，鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。具体地，若蜂蜜样本中吲哚-3-乙酸甲酯的含量介于17.91-363.75μg/kg，则判断所述蜂蜜样本为中蜂蜂蜜；若蜂蜜样本中吲哚-3-乙酸甲酯的含量介于0.99-9.69μg/kg，则判断所述蜂蜜样本为意蜂蜂蜜。作为优选，采用LC-QQQ检测蜂蜜样本中吲哚-3-乙酸甲酯的含量。作为优选，所述LC-QQQ中液相色谱条件如下：Agilent1290InfinitiyII；色谱柱：AgilentPoroshell，EC-C18，2.1×100mm，2.7μm；流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：乙腈；柱温：35℃。流动相梯度为：0-1min，10％的流动相B；2min，50％的流动相B；3min，70％的流动相B；4-5.5min，100％的流动相B；6-8min，10％的流动相B。在一些优选的实施方案中，进样体积为5μL。在一些优选的实施方案中，流速为0.3ml/min。作为优选，所述LC-QQQ中MS/MS条件如下：Agilent6495三重四级杆LC/MS/MS系统；模式：ESI+；干燥气温度：290℃；干燥气流速：12L/min；雾化器：45psi；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3500V；MRM参数设置如下：锥孔电压：380V；定量离子对：190.0＞130.1，碰撞能量：6eV；定性离子对：190.0＞103.0，碰撞能量：42eV。本专利技术同时采用定量离子对和定性离子对对蜂蜜中的吲哚-3-乙酸甲酯进行确证分析，设置该条件后可提高定性能力和定量能力，减少出现假阳性结果。具体地，MRM参数见表1。表1注：a为定量离子。基于本方法采用的仪器和公布的参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整。作为优选，在采用所述LC-QQQ进行检测前，对所述蜂蜜样本进行SPE前处理。优选地，所述SPE前处理具体为：将蜂蜜样品与乙腈水溶液混合，离心后经PCX固相萃取柱净化，所述PCX固相萃取柱预先用甲醇和水活化，淋洗液为水，洗脱液为氨化甲醇，复溶液为乙腈水溶液。进一步优选地，所述氨化甲醇中含有1％(v/v)异丙醇。在一个具体实施方案中，所述SPE前处理具体为：称取2g蜂蜜，加入8ml10％(v/v)乙腈水，涡旋，8000rpm下离心10min，经PCX固相萃取柱净化，PCX固相萃取柱预先用10ml甲醇和10ml水活化，全部上样后用10ml水淋洗，抽干，8ml10％(v/v)氨化甲醇(含1％(v/v)异丙醇)洗脱，40℃下氮气吹干，1ml10％(v/v)乙腈水复溶，尼龙膜过滤后进样。本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术首次提出以内源性小分子非挥发性物质吲哚-3-乙酸甲酯作为中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜鉴别的特征标志物，并确定了中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中吲哚-3-乙酸甲酯的含量范围。(2)本专利技术中的鉴别方法定量准确，稳定性强，便于操作和推广，对于准确识别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜有着重要意义，有利于促进蜂产品产业化发展，有利于养蜂行业健康和可持续发展。附图说明图1为实施例1中潜在差异物的VIP值；图2为中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的特征标志物吲哚-3-乙酸甲酯的一级质谱结构图；图3为中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的特征标志物吲哚-3-乙酸甲酯的二级质谱结构图；图4为实施例1中特征物质的碎片分子离子峰归属；图5为实施例1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.吲哚-3-乙酸甲酯在鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.吲哚-3-乙酸甲酯在鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中的应用。
2.一种中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别方法，其特征在于，以吲哚-3-乙酸甲酯的含量为鉴别依据，鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。
3.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，若蜂蜜样本中吲哚-3-乙酸甲酯的含量介于17.91-363.75μg/kg，则判断所述蜂蜜样本为中蜂蜂蜜；若蜂蜜样本中吲哚-3-乙酸甲酯的含量介于0.99-9.69μg/kg，则判断所述蜂蜜样本为意蜂蜂蜜。
4.根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，采用LC-QQQ检测蜂蜜样本中吲哚-3-乙酸甲酯的含量。
5.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于，所述LC-QQQ中液相色谱条件如下：Agilent1290InfinitiyII；色谱柱：AgilentPoroshell，EC-C18，2.1×100mm，2.7μm；流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：乙腈；柱温：35℃；流动相梯度为：0-1min，10％的流动相B；2min，50％的流动相B；3min，70％的流动相B；4-5.5min，10...
【专利技术属性】
技术研发人员：周金慧，王欣然，李熠，陈兰珍，杨术鹏，张金振，金玥，杨宇晖，赵文，王鹏，黄京平，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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