一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术制造技术

本发明专利技术公开了一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术，首先以细胞外囊泡表面蛋白为靶标设计适配体发卡，以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物，通过挂锁探针和连接序列杂交制备环状模板，适配体发卡与细胞外囊泡孵育后，发卡结构打开，从而与环状模板结合，在加入第二引物的情况下触发超分支滚环扩增，形成大量长度梯度的双链核酸，与核酸染料SYBR GreenⅠ结合能够产生强烈的荧光信号，而且荧光信号强弱与细胞外囊泡浓度呈正相关，从而可根据荧光强度定量检测出目标细胞外囊泡，游离的适配体发卡由于无法触发扩增，无需清洗。本发明专利技术提供的细胞外囊泡检测技术方法简单，特异性高，且细胞外囊泡免洗，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术。
技术介绍
细胞外囊泡(ExtracelluarVesicles,EVs)是细胞释放的膜衍生囊泡，根据起源机制和大小主要分为外泌体(30-200nm)、微囊泡(200-1000nm)和凋亡小体(50-5000nm)3种亚群。细胞外囊泡携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，与包括肿瘤发生、侵袭和转移在内的多种疾病进程密切相关。以细胞外囊泡作为液体活检的靶标，具有非侵入性、含量丰富、稳定存在、实时检测、信息全面等优势。滚环扩增是一种等温扩增技术，包括线性扩增和指数扩增(即超分支滚环扩增)，其中超分支滚环扩增效率更高，产物为长度梯度的双链核酸。超分支滚环扩增具有设备简单、灵敏度和特异性高、可以实现多重检测，以及反应温和，不会破坏生物分子结构和功能等优点，在生物传感器中有着广阔的应用前景。目前报道的细胞外囊泡检测技术在简便性和样本处理上存在一定问题，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)以目标细胞外囊泡表面蛋白为靶标设计适配体发卡以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物；/n(2)挂锁探针和连接序列杂交制备环状模板；/n(3)适配体发卡与细胞外囊泡混合孵育；/n(4)适配体发卡触发超分支滚环扩增：步骤(3)混合孵育后的适配体发卡与细胞外囊泡混合液中加入环状模板、第二引物和相关扩增试剂，组成超分支滚环扩增体系，混合孵育一段时间后，终止反应，获得超分支滚环扩增产物；/n(5)验证超分支滚环扩增产物，以检测出目标细胞外囊泡。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以目标细胞外囊泡表面蛋白为靶标设计适配体发卡以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物；
(2)挂锁探针和连接序列杂交制备环状模板；
(3)适配体发卡与细胞外囊泡混合孵育；
(4)适配体发卡触发超分支滚环扩增：步骤(3)混合孵育后的适配体发卡与细胞外囊泡混合液中加入环状模板、第二引物和相关扩增试剂，组成超分支滚环扩增体系，混合孵育一段时间后，终止反应，获得超分支滚环扩增产物；
(5)验证超分支滚环扩增产物，以检测出目标细胞外囊泡。


2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡检测技术，其特征在于：步骤(1)中，适配体发卡的3’端和5’端部分序列碱基互补，挂锁探针的3’端和5’端部分序列与连接序列碱基互补，第二引物与挂锁探针部分序列相同。


3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡检测技术，其特征在于：步骤(2)中，挂锁探针、连接序列、T4DNA连接酶缓冲液、T4DNA连接酶混合孵育，制备环状模板。


4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡检测技术，其特征在于：步骤(3)中，将PBS缓冲液稀释后的细胞外囊泡与0.2μM适配体发卡室温摇床孵育1h，转速为100rpm。

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【专利技术属性】
技术研发人员：李智洋，黄蓉蓉，何农跃，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32