数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒技术

本发明专利技术涉及核酸检测领域，特别涉及数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒。本发明专利技术提供的检测方法利用目标miRNA的整个序列信息，结合液滴微流控技术，构建了数字miRNA检测平台，具有较高的特异性和识别单碱基错配的能力。该平台能够在单分子水平上定量2‑20fM浓度范围内的miRNA，证明了该方法的有效性和实用性。首次实现了高选择性直接数字miRNA检测。

【技术实现步骤摘要】
数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒
本专利技术涉及核酸检测领域，特别涉及数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)检测在疾病诊断和miRNA功能研究中具有重要意义。miRNA本身的重要性在于它在各种生命过程中发挥的复杂调节功能及其与某些疾病的密切关系。miRNA是短的单链非编码RNA，长度范围为18-25nt，存在于真核细胞中。它们是由发夹样前体产生的，这些前体与RNA诱导的沉默复合物(RISC)中相应的靶mRNA碱基配对。由于碱基配对与其靶标完全或不完全互补，miRNA引起mRNA的降解或者抑制其翻译。miRNA表达水平在不同组织和器官中有所不同，并且受到精确调节；因此，它们的表达的功能障碍是有害的。由于miRNA短且高度同源，因此检测它们具有挑战性。用于检测miRNA的传统方法包括RT-PCR，RNA印迹，微阵列等；但是，这些方法中的每一种都有其各自的局限性。由于miRNA在体内的低丰度，某些靶向RNA的选择性扩增是必需的，数字化检测十分必要。值得注意的是，miRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.数字化miRNA检测的方法，其特征在于，荧光基团修饰的分子信标和靶标miRNA经过特异性杂交后，在引物和克列诺片段的作用下，利用游离的核苷酸，发生补齐双链的链置换反应，逐渐取代靶标miRNA与分子信标进行结合，最终以分子信标为模板链补齐双链分子，分子信标的荧光恢复，靶标miRNA被挤脱下来重新变成游离状态，检测荧光强度；/n所述分子信标探针的两端具有能够互补配对的序列，能够通过杂交配对形成茎环结构；/n所述靶标miRNA与分子信标的环状区域和部分茎干区的序列能够完全互补配对；/n同时与所述分子信标杂交后，所述引物和所述靶标miRNA之间留有至少2个碱基间隔。/n

【技术特征摘要】
1.数字化miRNA检测的方法，其特征在于，荧光基团修饰的分子信标和靶标miRNA经过特异性杂交后，在引物和克列诺片段的作用下，利用游离的核苷酸，发生补齐双链的链置换反应，逐渐取代靶标miRNA与分子信标进行结合，最终以分子信标为模板链补齐双链分子，分子信标的荧光恢复，靶标miRNA被挤脱下来重新变成游离状态，检测荧光强度；
所述分子信标探针的两端具有能够互补配对的序列，能够通过杂交配对形成茎环结构；
所述靶标miRNA与分子信标的环状区域和部分茎干区的序列能够完全互补配对；
同时与所述分子信标杂交后，所述引物和所述靶标miRNA之间留有至少2个碱基间隔。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基于液滴微流控技术生成的微液滴中进行，并对各个所述微液滴的反应单元的荧光信号进行统计学分析，实现直接数字化检测。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，基于液滴微流控技术，所述液滴微流控技术包括油相、第一水相和第二水相；所述第一水相通入靶标miRNA；所述第二水相通入引物、克列诺片段、游离的核苷酸、分子信标以及可接受的循环反应物。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：任大海，王斌，尤政，李静，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11