一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，提供了β‑烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括A磷酸化反应：在pH 8～10的碱性水溶液中，反应体系温度为25～50℃条件下，将烟酰胺核糖盐与偏磷酸盐进行磷酸化反应2～5h，得到烟酰胺单核苷酸盐的中间产物；B酸化反应：向反应溶液中加酸，调节pH值至3～5，并降低反应体系温度，将烟酰胺单核苷酸盐的中间产物酸化形成β‑烟酰胺单核苷酸；C产物纯化，将步骤B后的反应溶液依次经蛋白膜过滤、高压脱盐膜浓缩、阴离子交换树脂分离纯化、浓缩结晶后得到β‑烟酰胺单核苷酸纯品。

【技术实现步骤摘要】
一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法。
技术介绍
NMN(烟酰胺单核苷酸)是一种有机分子，也是一种核苷酸，人类的不少营养来源均含有这种物质，也是世界上首个经由严谨科学验证可以显著逆转衰老、延长寿命的革命性突破。烟酰胺单核苷酸抑制衰老作用于2014年由哈佛大学的DavidSinclair实验室初步发现,并在2016-2018年间由哈佛医学院、华盛顿大学、日本应庆大学等世界顶尖科研机构分别从提升体能、抑制衰老引起的认知能力下降、逆转血管死亡、保护心脑血管功能等多角度全方位证实其抑制衰老，延长寿命的显著效果。目前，烟酰胺单核苷酸的大规模合成方法主要是通过酶促反应来实现的(Burgos，E.S等人，Biochemistry，47:11086(2008)；Rozenberg，A等人，J.Org.Chem.,73:9314(2008))。但是酶促反应常常涉及到多种瓶颈，如酶法高昂的成本，反应条件苛刻，生产工艺不稳定，每个批次产品指标相差大，反应产能低等。前期有机合成化学家也做了一些努力，但是效果不理想，反应收率低，工艺复杂，成本高，用到一些有毒试剂，所有这些都严格限制了这些工艺的大规模应用(Jaemoon,L等人，Chem.Commun.,729–730(1999))。此外，发酵方法可能涉及到大家比较敏感的转基因技术，并且反应过程中可能会带来内毒素超标等问题，这给产品的最终应用带来很多隐患。因此，市场对于开发一种绿色、环保、高效、稳定的烟酰胺单核苷酸合成工艺有着迫切需求。
技术实现思路
本专利技术是为解决上述问题进行的，目的在于提供一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，以克服现有制备工艺存在的工艺不稳定、产品安全存在隐患以及工艺复杂等问题。本专利技术中β-烟酰胺单核苷酸的制备工艺概括如下：先将烟酰胺核糖盐(II)在碱性条件下进行磷酸化反应得到烟酰胺单核苷酸盐(III)，然后在酸性条件下酸化得到目标初产物(I)，再经纯化步骤后得到目标产物纯品，反应式如下：该β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，具体包括如下步骤：A、磷酸化反应在pH8～10的碱性水溶液中，反应体系温度为25～50℃条件下，将具有式II结构的烟酰胺核糖盐与偏磷酸盐进行磷酸化反应2～5h，得到具有式III结构的中间产物；B、酸化反应向反应溶液中加酸，调节pH值至3～5，并降低反应体系温度，将具有式III结构的中间产物酸化形成具有式I结构的β-烟酰胺单核苷酸；C、产物纯化将步骤B后的反应溶液依次经蛋白膜过滤、高压脱盐膜浓缩、阴离子交换树脂分离纯化、浓缩结晶后得到β-烟酰胺单核苷酸纯品。优选的，在步骤A中，式(III)中的M为钠或钾元素，偏磷酸盐为偏磷酸钠或偏磷酸钾，偏磷酸盐中的三偏磷酸钠含量以P2O5计，含量大于68％，1％的水溶液pH值为6.2。所采用的碱性水溶液为氢氧化钠，氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙以及氢氧化镁水溶液中的任意一种。反应体系pH值为9，反应温度优选为30℃，反应时长为4h，通过在线反应监测，反应4小时后，原料消耗殆尽。优选的，在步骤B中，所添加的酸为无机酸或有机酸：无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸或磷酸；有机酸包括对甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸、马来酸、酒石酸、脂肪酸或长链脂肪酸。反应体系温度为10℃，加酸调节后，反应溶液的pH值为3.5。将反应体系温度设定为10℃的原因在于，步骤A中为碱性环境，步骤B中要求酸性反应环境，进行酸调节过程中，酸碱反应放热量较大，若不先降温容易对中间产物结构造成损害。优选的，步骤C中，所采用的蛋白膜分子量为30000-50000，高压脱盐膜为8040纳滤膜。在脱盐前，先将反应溶液加水稀释四倍，采用8040纳滤膜将其浓缩八倍；然后向浓缩中加水至第一次脱盐前体积，并采用8040纳滤膜将其浓缩八倍，而后重复该脱盐步骤至少一次。在阴离子交换树脂分离纯化过程中，所采用的阴离子交换树脂为201*7型阴离子树脂，样品上柱后，先用清水淋洗一遍，然后用两倍清水体积的0.003M的氯化氢水溶液洗脱产品，洗脱速度控制在1-1.5L/h，并收集产品。在浓缩结晶过程中，所采用的结晶溶液为甲醇，乙醇，异丙醇以及丙酮任意两种混合液。在结晶前，先采用低温蒸发或纳滤膜浓缩的方式浓缩收集的产品溶液，然后加入至结晶溶液中搅拌，并干燥析出的固体，得到β-烟酰胺单核苷酸纯品。专利技术的作用与效果根据本专利技术提供的β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，以烟酰胺核糖盐为反应初原料，仅涉及烟酰胺核糖盐磷酸化反应，以及烟酰胺单核苷酸盐的酸化反应两个主要反应步骤，所涉及的原料主要为碱液或酸液，反应过程中既无需酶进行催化，也用不到有毒试剂，更不涉及发酵方法中的转基因技术。因此，本专利技术中的β-烟酰胺单核苷酸的制备方法与酶促反应相比，原料成本低，工艺条件温和、稳定、易控，导致不同批次产品指标接近，有助于提高反应产能；与化学合成方法和发酵方法对比，本专利技术制备方法得到的产品安全性高，提高了产品的应用前景。附图说明图1是本专利技术实施例一中制备的β-烟酰胺单核苷酸的核磁氢谱；图2是本专利技术实施例一中制备的β-烟酰胺单核苷酸的13C核磁谱图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细描述。但下列实施例不应看作对本专利技术范围的限制。实施例1步骤A：制备烟酰胺单核苷酸钠盐：在2000mL的三口烧瓶中加入烟酰胺核糖氯化物(100g，0.344mol)，加入1000mLpH＝9的氢氧化钠水溶液。控温30℃至稳定后，加入三偏磷酸钠(STMP)(110.48g，0.361mol)反应4小时。高效液相色谱监控反应进程，HPLC显示85％的起始原料在4小时后消耗，产品烟酰胺单核苷酸的含量占比为83％。步骤B：制备烟酰胺单核苷酸将反应体系降温至10℃，加入1M盐酸，调节反应体系pH值至3.5，对烟酰胺单核苷酸钠盐进行酸化，变成具有结构I的内盐形式。步骤C：烟酰胺单核苷酸纯化加入3L水稀释反应液浓度后，先采用分子量为30000～50000的蛋白膜过滤；而后用8040纳滤膜高压脱盐浓缩至500mL后，再加水3L稀释后，继续用高压脱盐膜浓缩至500mL，重复3次后，体系残留的盐基本除尽。加水3L稀释后，加1M氢氧化钠水溶液调节pH值为8，用201*7型阴离子树脂10Kg，进行纯化分离。样品上柱后，用3L清水淋洗一遍，然后用6L0.003M的氯化氢水溶液洗脱产品，洗脱速度控制在1-1.5L/h，收集含有产品的部分1.8L。用纳滤膜浓缩至300mL后，加入甲醇/异丙醇＝1：1体积比的混合液300mL后，搅拌10分钟，析出白色固体。过滤烘干后得到白色固体78g，收率68％，纯度99.5％。将得到的产品进行核磁氢本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/nA、磷酸化反应/n在pH 8～10的碱性水溶液中，反应体系温度为25～50℃条件下，将具有式II结构的烟酰胺核糖盐与偏磷酸盐进行磷酸化反应2～5h，得到具有式III结构的中间产物，反应过程如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、磷酸化反应
在pH8～10的碱性水溶液中，反应体系温度为25～50℃条件下，将具有式II结构的烟酰胺核糖盐与偏磷酸盐进行磷酸化反应2～5h，得到具有式III结构的中间产物，反应过程如下：



B、酸化反应
向反应溶液中加酸，调节pH值至3～5，并降低反应体系温度，将具有式III结构的中间产物酸化形成具有式I结构的β-烟酰胺单核苷酸：



C、产物纯化
将步骤B后的反应溶液依次经蛋白膜过滤、高压脱盐膜浓缩、阴离子交换树脂分离纯化、浓缩结晶后得到β-烟酰胺单核苷酸纯品。


2.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：
其中，步骤A中，M为钠或钾元素，偏磷酸盐为偏磷酸钠或偏磷酸钾，
所述碱性水溶液为氢氧化钠，氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙以及氢氧化镁水溶液中的任意一种。


3.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：
其中，步骤A中，反应体系pH值为9，反应温度为30℃，反应时长为4h。


4.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：
其中，步骤A中，所述偏磷酸盐中的三偏磷酸钠含量以P2O5计，含量大于68％，1％的水溶液pH值为6.2。


5.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于：
其中，步骤B中，所添加的酸为无机酸或有机酸，<...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐钦源，余建军，胡健，
申请(专利权)人：音芙医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31