含有胺掩蔽的部分的核苷酸衍生物及其在模板化和非模板化酶促核酸合成中的用途制造技术

本发明专利技术涉及胺掩蔽的部分在酶促核酸合成方法中的用途。本发明专利技术还涉及所述胺掩蔽的部分本身和制备包含所述胺掩蔽的部分的三磷酸核苷酸的方法。

Nucleotide derivatives containing amine masked moiety and their application in template and non template enzymatic synthesis of nucleic acids

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含有胺掩蔽的部分的核苷酸衍生物及其在模板化和非模板化酶促核酸合成中的用途专利
本专利技术涉及胺掩蔽的部分在酶促核酸合成方法中的用途。本专利技术还涉及所述胺掩蔽的部分本身和制备包含所述胺掩蔽的部分的三磷酸核苷酸的方法。
技术介绍
核酸合成对于现代生物技术是至关重要的。科学界人工合成DNA、RNA和蛋白质的能力使生物
的快速发展成为可能。人工DNA合成(一个10亿英镑且不断增长的市场)使生物技术和制药公司能够开发一系列肽疗法，例如用于治疗糖尿病的胰岛素。它使研究人员能够表征细胞蛋白，从而开发新的小分子疗法，以治疗当今人口老龄化所面临的疾病，例如心脏病和癌症。正如Venter研究所在2010年将人工合成的基因组放入细菌细胞中时所证明的那样，它甚至为创造生命铺平了道路。但是，当前的DNA合成技术不能满足生物技术工业的需求。尽管DNA合成的益处很多，但一个经常提到的问题阻碍了人工DNA合成工业的进一步发展，从而阻碍了生物
的进一步发展。虽然是一项成熟的技术，但实际上不可能合成长度超过200个核苷酸的DNA链，并且大多数DNA合成公司仅提供最多120个核苷酸。相比之下，平均蛋白质编码基因的数量级为2000-3000个核苷酸，而真核基因组的平均数量为数十亿个核苷酸。因此，目前所有主要的基因合成公司都依赖“合成和拼接”技术的变体，其中，合成重叠的40-60聚体片段并通过PCR拼接到一起(参见Young,L等人，(2004)NucleicAcidRes.32,e59)。目前由基因合成工业提供的方法一般允许常规生产长达3kb的长度。DNA不能一次合成超过120-200个核苷酸的原因是由于目前的DNA生成方法，该方法使用合成化学方法(即亚磷酰胺技术)一次偶联一个核苷酸来制备DNA。由于每个核苷酸偶联步骤的效率为95.0-99.0％，因此从数学上讲，不可能以可接受的产率合成长度超过200个核苷酸的DNA。Venter研究所花费4年时间和2000万美元来合成相对较小的细菌基因组，从而说明了这一费力的过程(参见Gibson,D.G.等人,(2010)Science329,52-56)。已知的DNA测序方法使用模板依赖性DNA聚合酶将3'-可逆终止的核苷酸加入到生长的双链底物中(参见Bentley,D.R.等人,(2008)Nature456,53-59)。在“合成测序”过程中，每个添加的核苷酸都包含一种染料，从而使用户可以识别模板链的确切序列。虽然是在双链DNA上，但这种技术仍能够产生500-1000碱基对长的链。但是，由于需要现有的核酸链作为模板，因此该技术不适于核酸的从头合成。-ONH2化学部分可用于多种生物技术应用，例如合成测序(SBS)、模板化酶促DNA合成和非模板化酶促DNA合成(D.Hutter等人，NucleotidesNucleicAcids.29.(2010)879-895)。具体而言，-ONH2化学部分的用途在于其可逆地掩蔽-OH官能团的能力，例如5'-三磷酸核苷酸中2'-脱氧核糖或核糖上的3'-OH位置。另外，与其它可逆终止部分如-OCH2N3相反，-ONH2化学部分的小尺寸使其成为酶(如聚合酶)的更好底物。然而，将-ONH2化学部分脱保护所需的条件是不利的。用于将-ONH2转化为-OH的常用化学试剂是在酸性条件下的亚硝酸钠。问题是，如图1和4以及许多以前的研究所示(F.Kaudewitz,Nature.183(1959)1829-1830,F.Kodama等人,Mutat.Res.40(1976)119-124,R.Shapiro和S.H.Pohl,Biochemistry.7(1968)448-455)，在亚硝酸钠存在下，腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶的氧化脱氨反应的速率很高。这些碱基的脱氨基化将腺嘌呤转化为次黄嘌呤，将胞嘧啶转化为尿嘧啶，将鸟嘌呤转化为黄嘌呤。这些转化导致明显的突变，如次黄嘌呤与胞嘧啶配对，尿嘧啶与腺嘌呤配对。因此，这些突变限制了-ONH2可逆终止子的实际应用，特别是在用于合成生物学应用的非模板化酶促DNA合成中。已经提出添加类黄酮和其它酚类化合物作为减少核酸含氮杂环在亚硝酸钠的存在下脱氨基的潜在解决方案(C.Oldreive等人，Chem.Res.Toxicol.11(1998)1574-1579)。虽然先前的研究已经显示某些添加剂可防止核酸碱基脱氨基，但是相同的添加剂也会抑制实现可逆终止所需的3'-ONH2向3'-OH的转化。因此，类黄酮和其它酚类化合物的使用对于非模板化酶促DNA合成的用途有限。因此，需要提供一种改进的核酸合成方法，其能够克服与目前可用的方法相关的问题。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，提供了胺掩蔽的含氮杂环例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤的衍生物在酶促核酸合成方法中的用途。根据本专利技术的另一方面，提供了式(I)化合物在酶促核酸合成方法中的用途：其中：R1代表能够被去掩蔽以显现羟基的部分，包括-H、-OH、-ONH2、-ONC(CH3)2、-OCH2N3、-OCH2CHCH2、-OPO32-、-OCH2SSCH2CH3、-OCOCH3、-OCH2CH2CN、-O-甲氧基乙基、-O-烷基或-O-烷氧基；R2代表-H、-OH、-ONH2、-ONC(CH3)2、-OCH2N3、-OCH2CHCH2、-OPO32-、-OCH2SSCH2CH3、-OCOCH3、-OCH2CH2CN、-O-甲氧基乙基、-O-烷基、-O-烷氧基或任何其它分子部分；X代表-OH基团或一个或多个磷酸酯基、硫代磷酸酯基、硼化磷酸酯基(boranophosphate)或亚氨基磷酸酯基团或其任何组合，其中所述基团能够赋予酶促加成的能力；R3代表胺掩蔽基团，其中所述氨基参与与互补碱基的氢键碱基配对，并且所述氨基的脱氨基化可导致与互补碱基的氢键键合改变；并且B代表含氮杂环。根据本专利技术的另一方面，提供了式(I)a化合物：其中：R1代表能够被去掩蔽以显现羟基的部分，包括-H、-OH、-ONH2、-ONC(CH3)2、-OCH2N3、-OCH2CHCH2、-OPO32-、-OCH2SSCH2CH3、-OCOCH3、-OCH2CH2CN、-O-甲氧基乙基、-O-烷基或-O-烷氧基；R2代表-H、-OH、-ONH2、-ONC(CH3)2、-OCH2N3、-OCH2CHCH2、-OPO32-、-OCH2SSCH2CH3、-OCOCH3、-OCH2CH2CN、-O-甲氧基乙基、-O-烷基、-O-烷氧基或任何其它分子部分；X代表一个或多个磷酸酯基、硫代磷酸酯基、硼化磷酸酯基或亚氨基磷酸酯基团或其任何组合，其中所述基团能够赋予酶促加成的能力；R3代表胺掩蔽基团，其中所述氨基参与与互补碱基的氢键碱基配对，并且所述氨基的脱氨基化可导致与互补碱基的氢键键合改变；并且B代表含氮杂环。根据本专利技术的另一方面，提供了一种制备式(V)化合物的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.胺掩蔽的含氮杂环例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤的衍生物在酶促核酸合成方法中的用途。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171114 GB 1718804.61.胺掩蔽的含氮杂环例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤的衍生物在酶促核酸合成方法中的用途。


2.式(I)化合物在酶促核酸合成方法中的用途：



其中：
R1代表能够被去掩蔽以显现羟基的部分，包括
-H、-OH、-ONH2、-ONC(CH3)2、-OCH2N3、-OCH2CHCH2、-OPO32-、-OCH2SSCH2CH3、-OCOCH3、-OCH2CH2CN、-O-甲氧基乙基、-O-烷基或-O-烷氧基；
R2代表-H、-OH、-ONH2、-ONC(CH3)2、-OCH2N3、-OCH2CHCH2、-OPO32-、-OCH2SSCH2CH3、-OCOCH3、-OCH2CH2CN、-O-甲氧基乙基、-O-烷基、-O-烷氧基或任何其它分子部分；
X代表-OH基团或一个或多个磷酸酯基、硫代磷酸酯基、硼化磷酸酯基或亚氨基磷酸酯基团或其任何组合，其中所述基团能够赋予酶促加成的能力；R3代表胺掩蔽基团，其中所述氨基参与与互补碱基的氢键碱基配对，并且所述氨基的脱氨基化可导致与互补碱基的氢键键合改变；并且
B代表含氮杂环。


3.权利要求2所定义的用途，其中式(I)的化合物选自：



其中R2如权利要求2中所定义，例如-OH或-H。


4.权利要求2所定义的用途，其中式(I)的化合物选自式(I)b至(I)j的化合物，例如(I)b。


5.权利要求2所定义的用途，其中X代表-OH基团或三磷酸酯基团。


6.权利要求2至5任意一项所定义的用途，其中的氢键碱基配对选自：Watson-Crick、Hoogsteen或替代/扩展的遗传密码碱基配对。


7.权利要求2至6任意一项所定义的用途，其中R1和R2独立地代表--H、-OH、-ONH2、-ONC(CH3)2、-OCH2N3、-OCH2CHCH2、-OPO32-、-OCH2SSCH2CH3、-OCOCH3、-OCH2CH2CN、-O-甲氧基乙基、-O-烷基或-O-烷氧基或适宜的羟基保护基。


8.权利要求2至7任意一项所定义的用途，其中R3选自叠氮化物(-N3)、苯甲酰基胺(N-苯甲酰基或-NHCOPh)、N-甲基(-NHMe)、异丁酰基胺、二甲基甲酰氨基胺、9-芴基甲基氨基甲酸酯、叔丁基氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯、乙酰胺(N-乙酰基或-NHCOMe)、三氟乙酰胺、邻苯二甲酰胺、苄基胺(N-苄基或-NH-CH2-苯基)、三苯基甲基胺、亚苄基胺、甲苯磺酰基胺、异硫氰酸酯、N-烯丙基(例如N-二甲基烯丙基(-NHCH2-CH＝CH2))和N-茴香酰基(-NHCOPh-OMe)，例如叠氮化物(-N3)、N-乙酰基(-NHCOMe)、N-苄基(-NH-CH2-苯基)、N-茴香酰基(-NHCOPh-OMe)、N-甲基(-NHMe)、N-苯甲酰基(-NHCOPh)、N-二甲基烯丙基(-NHCH2-CH＝CH2)。


9.权利要求2至8任意一项所定义的用途，其中B代表选自嘌呤或嘧啶或其衍生物的含氮杂环。


10.权利要求2至9任意一项所定义的用途，其中-B-R3代表：





11.权利要求2至10任意一项所定义的用途，其中R3代表叠氮化物(-N3)基团并且–B-R3选自：





12.式(I)a的化合物：



其中：
R1代表能够被去掩蔽以显现羟基的部分，包括
-H、-OH、-ONH2、-ONC(CH3)2、-OCH2N3、-OCH2CHCH2、-OPO32-、-OCH2SSCH2CH3、-OCOCH3、-OCH2CH2CN、-O-甲氧基乙基、-O-烷基或-O-烷氧基；
R2代表-H、-OH、-ONH2、-ONC(CH3)2、-OCH2N3、-OCH2CHCH2、-OPO32-、-OCH2SSCH2CH3、-OCOCH3、-OCH2CH2CN、-O-甲氧基乙基、-O-烷基、-O-烷氧基或任何其它分子部分；
X代表一个或多个磷酸酯基、硫代磷酸酯基、硼...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·C·陈，G·R·米钦罗伊，
申请(专利权)人：核酸有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB