用于无细胞蛋白质表达的方法技术

公开了一种用于在液体填充的数字微流体装置中肽或蛋白质的无细胞表达的方法。具有无细胞蛋白质表达所需组分的液滴可以通过电运动来操纵，以便提高液滴中蛋白质表达的水平。以便提高液滴中蛋白质表达的水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于无细胞蛋白质表达的方法
[0001]专利技术的领域
[0002]公开了一种用于在数字微流体装置中肽或蛋白质的无细胞表达的方法。可以通过电运动来操纵具有无细胞蛋白质合成(CFPS)(另外也被称为体外蛋白质合成)所需的组分的液滴，从而影响和改善蛋白质表达。
[0003]专利技术的背景
[0004]电润湿是采用施加的电场对表面(其通常是疏水的)的润湿性的改变。已经广泛描述了用于基于电润湿操纵液滴或磁珠的微流体装置。在液滴在通道中的情况下，这可以通过使液滴，例如在存在不混溶载体流体的情况下经过由筒或微流体管的壁限定的微流体通道来实现。嵌入筒或管的壁中的电极被电介质层覆盖，每个电极连接到A/C偏压电路，所述A/C偏压电路能够被间隔地快速接通和断开，以改变层的电润湿场特性。这形成了沿给定路径控制液滴的能力。
[0005]作为微流体通道系统的替代方案，还可以使用数字微流体(DMF)在平面表面上生成和操纵液滴。与基于通道的微流体相比，DMF利用电极阵列上的交流电流使流体在阵列表面上移动。因此，可以通过电润湿使液体在开放式装置上移动。数字微流体实现对液滴移动的精确控制，包括液滴融合和分离。
[0006]也被称为体外蛋白质合成或CFPS的无细胞蛋白质合成是在无细胞系统中，即在不使用活细胞的情况下使用生物机器生产肽或蛋白质。体外蛋白质合成环境不被约束在细胞壁内或被保持细胞活力所必需的条件限制，并且实现由核酸模板，一般是来自体外转录的质粒DNA或RNA快速生产任何所期望的蛋白质。CFPS已经被知晓数十年，并且有许多商业系统是可用的。无细胞蛋白质合成包括基于粗裂解物的系统(Cold Spring Harb Perspect Biol.2016Dec；8(12):a023853)和基于重构的、纯化的分子试剂的系统，如用于蛋白质生产的PURE系统(Methods Mol Biol.2014；1118:275
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284)。CFPS需要高浓度的生物大分子，包括DNA、RNA、蛋白质、多糖、分子拥挤剂等(Febs Letters 2013,2,58,261
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268)。
[0007]Lab Chip,2012,12,882(题为“A completely in vitro ultrahigh
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throughput droplet
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based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution”)描述了一种基于流动毛细管通道中的液滴的系统，而非基于三维阵列的EWOD系统。
[0008]美国专利申请20210016283描述了用于高通量蛋白质表达的微孔阵列系统。
[0009]题为“Portable Fluidic Platform For Rapid Cell
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Free Production of Protein Biologics”的US20160230203A1描述了一种集成的流体平台，其包括与实现蛋白质生物制品生产的快速蛋白质纯化和表征模块耦合的无细胞蛋白质合成系统。
[0010]US10464067描述了空气
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矩阵数字微流体(DMF)设备和使用它们来防止或限制DMF设备的蒸发和表面污染的方法。
[0011]迄今为止，总体上仅仅发现了数字微流体、电介质上的电润湿(EWoD)和电运动在无细胞的基于生物制品的应用中的有限用途，主要是由于生物污染，其中生物组分，如蛋白质、核酸、粗细胞提取物和其他生物产品吸附疏水表面和/或使疏水表面变性。生物污染是
本领域中公知的，其限制EWoD装置操纵包含生物大分子的液滴的能力。Wheeler和同事们报告，包含生物介质的EWoD装置上的液滴的最大致动时间为在生物污染抑制基于EWoD的液滴致动之前的30分钟(Langmuir 2011,27,13,8586
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8594)。
[0012]数字微流体可以在空气填充的系统中进行，其中在空气中在表面上操纵液滴。然而，在升高的温度下或长时段内，挥发性水性液滴仅仅通过蒸发就变干到表面上。纳升和微升大小的液滴的高表面积与体积比加剧了这个问题。因此，空气填充的系统通常不适合蛋白质表达，其中系统的温度需要保持在适合酶活性的温度并且合成的持续时间需要延长以使合成的蛋白质水平是可检测的。
[0013]蛋白质表达通常需要充足的氧供应。驱动CFPS的最方便和高产的方式是经由O2充当最终电子受体的氧化磷酸化；然而，存在涉及用不参与氧化磷酸化的能量分子补充的其他方式。在受限制的液滴的微流体或数字微流体系统中，不足的氧可用来实现有效的蛋白质合成。
[0014]由于上述限制，在EWoD装置上使用无细胞系统和核糖体提取物已经被限制到概念性讨论，因为生物学过程通常需要在高于室温的温度下孵育数小时以实现预期结果(Biomicrofluidics 2013,7,014108)。因此，尽管现有技术中存在关于在微流体装置中进行CPFS的可用性(desirability)的建议，但实际工作的系统从未得到证明。
[0015]专利技术的概述
[0016]本文描述实现在数字微流体装置中肽或蛋白质的无细胞表达的改进方法。包括一种用于在微流体装置中肽或蛋白质的无细胞表达的方法，其中所述方法包括一个或多个包含核酸模板(即，DNA或RNA)的液滴和具有用于在填充油的环境中表达蛋白质的组分的无细胞系统，以及使用电运动移动所述液滴。用于无细胞蛋白质合成液滴的组分可以在引入数字微流体装置之前预混合或者在数字微流体装置上混合。
[0017]在表达蛋白质的同时，液滴可以重复地移动达至少30分钟的时段。在表达蛋白质的同时，液滴可以重复地移动达至少2小时的时段。在表达蛋白质的同时，液滴可以重复地移动达至少12小时的时段。移动液滴的动作使得氧被供应到液滴并分散到整个液滴中。移动的动作提高保持静态的液滴内的蛋白质表达的水平。
[0018]可以使用任何电运动手段移动液滴。可以使用电介质上的电润湿(EWoD)移动液滴。EWoD或光学EWoD装置上的电信号可以通过分段电极、有源矩阵薄膜晶体管或数字微镜传递。
[0019]装置中的油可以是任何与水不混溶的液体。油可以是矿物油、硅油、如癸烷或十二烷的基于烷基的溶剂、或氟化油。油可以在表达过程之前或期间被充氧。或者，装置可以是其中包含无细胞蛋白质合成试剂的液滴在加湿气体下快速移动到位并被固定到阵列中以防止蒸发的空气填充的装置。加湿可以通过封闭或密封数字微流体装置并提供搭载的(on
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board)试剂储备(reservoir)来实现。另外，可以通过将含水储备连接到封闭或密封的数字微流体装置来实现加湿。含水储备可以具有限定的温度或溶质浓度，从而提供特定的相对湿度(例如，在30℃下的饱和硫酸钾溶液)。另外，可以使用液体蜡材料来防止蒸发。
[0020]可以向液滴供应补充氧的来源。例如，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在数字微流体装置中肽或蛋白质的无细胞表达的方法，其中所述方法包括一个或多个包含核酸模板的液滴和具有用于在填充油的或加湿的气态环境中表达蛋白质的组分的无细胞系统，以及使用电介质上的电润湿(EWoD)移动所述液滴。2.根据权利要求1所述的方法，其中在发生无细胞蛋白质表达的同时，所述液滴重复移动达至少30分钟的时段。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述加湿的含水气态环境是通过封闭或密封所述数字微流体装置并提供搭载的(on
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board)试剂储备来实现的。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述EWoD或光学EWoD装置上的电信号通过分段电极、有源矩阵薄膜晶体管或数字微镜传递。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述油是矿物油、硅油、如癸烷或十二烷的基于烷基的溶剂、或氟化油。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述油被充氧。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述液滴移动达至少2小时的时段。8.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中向所述液滴供应补充氧的来源。9.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中温度保持在19℃或高于19℃。10.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述无细胞系统是用于蛋白质表达的无细胞提取物。11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述无细胞系统是由单一试剂制备的。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其包括将包含核酸质粒的第一液滴与包含具有用于蛋白质表达的组分的无细胞系统的第二液滴合并，以在所述微流体装置上形成液滴。...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：核酸有限公司，
类型：发明
国别省市：