用于快速检测烟曲霉的序列、试剂盒、方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种用于快速检测烟曲霉的序列，其包括烟曲霉‑crRNA序列、以及相应的带有T7启动子的RPA扩增引物序列，其中，所述烟曲霉‑crRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RPA扩增引物序列的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述RPA扩增引物序列的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术能够简易、快速、高特异性、灵敏地检测待测样本中的烟曲霉。

Sequence, kit, method and application for rapid detection of Aspergillus fumigatus

【技术实现步骤摘要】
用于快速检测烟曲霉的序列、试剂盒、方法及应用
本专利技术属于生物化学领域，具体涉及曲霉菌检测方法，特别是一种用于快速检测烟曲霉的序列、试剂盒、方法及应用。
技术介绍
侵袭性肺曲霉病(invasivepulmonaryaspergillosis，IPA)是指曲霉菌菌丝生长侵入肺实质而引起的感染性疾病，具有发病急性、进展迅速、病死率高的特点。烟曲霉是引起IPA最常见的病原菌，文献报道若IPA肺炎症状发生10天后抗真菌治疗，患者死亡率高达90％，而早期抗真菌治疗的死亡率可降低至41％。快速准确鉴定烟曲霉能指导临床选择抗真菌药、争取治疗时间。早期诊断和及时治疗是良好预后的关键。但由于该病缺乏典型的临床表现，早期诊断尤为困难。实验室曲霉菌的鉴定方法主要有病原体分离培养、病理组织鉴定、免疫学检测、核酸检测。但是传统的病原体分离培养耗时长、阳性率低。而病理组织鉴定受到样本采集的限制、免疫学检测灵敏度不高，不能够区分不同的菌种，因此不能鉴定是否烟曲霉感染，而且常常发生假阳性或假阴性。核酸检测方法主要以近就广泛应用的聚合酶链反应(PCR)技术及一些新兴的恒温扩增技术为主。基于PCR的检测技术近年逐渐成为临床分子诊断最成熟的核酸检测方法，具有更高的灵敏度和检测速度更快，但标本采集、运输等环节以及患者使用抗生素治疗等因素可导致标本中烟曲霉含量的减少，会影响到PCR核酸检测的敏感性。近年来开发的LAMP(Loop-mediatedisothermalamplification，环介导等温扩增技术)更为简单、经济，时间上比qPCR快2.5倍，当敏感度相同时，LAMP的特异度优于PCR。然而，曲霉由于种类繁多，种之间、种属之间(与其他属比如念珠菌属、隐球菌属等)的核酸序列同源性较高，同时，整个真菌基因组发生变异的几率远大于人类基因组，使得可选择做为靶基因序列进行种属检测的基因序列不多，因此，对于设计特异性检测常见曲霉(如烟曲霉)的扩增引物和crRNA的难度比较大。重组酶-聚合酶扩增(RPA)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和具有链置换功能的DNA聚合酶，在室温(最适反应温度为37℃～42℃)下即可获得可检测级别的扩增核酸。但是，原理上其单级扩增反应的本质并未改变，相较于目前市场上多数的qPCR检测方式，并不能有实质性的灵敏度提升。自2017年开始，越来越多的文献报道CRISPR-Cas基因编辑技术可应用于临床分子诊断。在CRISPR-Cas系统中，Cas蛋白在向导RNA的引导下，靶向目标序列后启动其自身的“附带切割”活性，如果同时在体系中加入荧光报告分子(常用的报告分子是一段寡核苷酸序列，一端带有一个发光基团，一端带有一个淬灭基团，正常情况下由于淬灭作用，完整的报告分子不会被检测到，当寡核苷酸分子被水解后，游离的荧光信号可以被检测到)，借用Cas酶附带切割活性，可以实现待检序列信息向荧光信号的转化。并且通过RPA与CRISPR-Cas的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联”(Cas酶完成)的两级放大，从而超越qPCR这种单级扩增的灵敏度。此外，因为RPA扩增方式无需复杂的温度改变，从而摆脱了对qPCR仪等复杂变温扩增仪器的依赖，使得CRISPR-Cas技术在烟曲霉的即时诊断方面具有广阔的应用前景，最快可实现40分钟检测出结果，大大缩短了检测时间，能避免更大范围的疫病传染，有着巨大的应用优势。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够简易、快速、高特异性、灵敏地检测烟曲霉的技术方案。为了实现以上专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：一种用于快速检测烟曲霉的序列，其包括烟曲霉-crRNA序列、以及相应的带有T7启动子的RPA扩增引物序列，其中，所述烟曲霉-crRNA序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述RPA扩增引物序列的正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述RPA扩增引物序列的反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。优选地，所述RPA扩增引物序列的终浓度为0.1～1μmol/L，所述烟曲霉-crRNA的终浓度为20～200nmol/L。另一方面，本专利技术还提供了一种试剂盒，其含有根据本专利技术所述的用于快速检测烟曲霉的序列，还含有RPA酶预混液、信号报告探针、LwCas13a蛋白、醋酸镁、T7RNA聚合酶混合液、NTP缓冲液混合液。优选地，所述RPA酶预混液中含有磷酸肌酸、肌酸激酶、dNTPs、ATP、DTT、醋酸钾、重组酶uxsX、重组酶uxsY、单链结合蛋白和Bsu聚合酶。另一方面，本专利技术还提供了一种快速检测烟曲霉的方法，其包括以下步骤：步骤一：提取待检测样本的DNA；步骤二：利用RPA和CRISPR一步法检测体系对烟曲霉核酸进行扩增和信号检测，其中使用根据权利要求1或2所述的用于快速检测烟曲霉的序列。优选地，所述步骤二中，所述RPA和CRISPR一步法检测体系包括第一部分和第二部分；所述第一部分含有浓度为10μM的RPA正向引物0.5-2.5μL、浓度为10μM的RPA反向引物0.5-2.5μL、RPA酶预混液21μL，其中所述RPA酶预混液含有浓度为20-80mM的磷酸肌酸、浓度为50-150mM的肌酸激酶、浓度为100-300μM的dNTPs、浓度为20-80mM的ATP、浓度为1-10mM的DTT、浓度为50-200mM的醋酸钾、浓度为50-300ng/μL的重组酶uxsX、浓度为10-100ng/μL的重组酶uxsY、浓度为200-1000ng/μL的单链结合蛋白以及浓度为10-100ng/μL的Bsu聚合酶；所述第二部分含有浓度为1-5μM的Lwcas13a蛋白1μL、浓度为1-5μM的crRNA1μL、T7RNA聚合酶混合液0.2-2μL、NTP缓冲液混合液1-10μL和浓度为1-10μM的信号报告探针1μL。更优选地，将所述第一部分配制好后震荡离心把体系收集于管子底部，再加入所述第二部分，于恒温37℃反应10-30分钟后，震荡混匀后离心，读取FAM荧光值。另一方面，本专利技术还提供了所述用于快速检测烟曲霉的序列在用于制备烟曲霉检测试剂中的应用。与现有技术相比，本专利技术的技术方案通过优选烟曲霉的特定序列，来设计Cas13a对应的crRNA，进行荧光检测，提高了检测的灵敏度，实现反应体系里接近单个基因组拷贝的检测，本专利技术的基于CRISPR-Cas技术的优选特定序列组合缩短了烟曲霉的检测时间，最快可40min完成检测，该序列组合及试剂盒灵敏性高、特异性强、操作简便、检测速度快。附图说明图1是烟曲霉crRNA序列验证筛选结果的图2是烟曲霉引物筛选结果。图3是烟曲霉体系灵敏度分析结果。图4是烟曲霉体系特异性分析结果。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术，而非用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于快速检测烟曲霉的序列，其包括烟曲霉-crRNA序列、以及相应的带有T7启动子的RPA扩增引物序列，其中，所述烟曲霉-crRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RPA扩增引物序列的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述RPA扩增引物序列的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测烟曲霉的序列，其包括烟曲霉-crRNA序列、以及相应的带有T7启动子的RPA扩增引物序列，其中，所述烟曲霉-crRNA序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述RPA扩增引物序列的正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述RPA扩增引物序列的反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


2.根据权利要求1所述的序列，其特征在于，所述RPA扩增引物序列的终浓度为0.1～1μmol/L，所述烟曲霉-crRNA的终浓度为20～200nmol/L。


3.一种试剂盒，其含有根据权利要求1或2所述的用于快速检测烟曲霉的序列，还含有RPA酶预混液、信号报告探针、LwCas13a蛋白、醋酸镁、T7RNA聚合酶混合液和NTP缓冲液混合液。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA酶预混液中含有磷酸肌酸、肌酸激酶、dNTPs、ATP、DTT、醋酸钾、重组酶uxsX、重组酶uxsY、单链结合蛋白和Bsu聚合酶。


5.一种快速检测烟曲霉的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：提取待检测样本的DNA；
步骤二：利用RPA和CRISPR一步法检测体系对烟曲霉核酸进行扩增和信号检测，其中使用根据权利要求1或2所述的用于快速检测烟曲霉的序列。


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【专利技术属性】
技术研发人员：叶枫，李征途，李少强，占扬清，成静，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院，广州呼吸健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44