一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的SSR引物及方法技术

本发明专利技术提供一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的SSR引物SSR06；本发明专利技术还提供了一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的方法，包括：步骤1，提取待测样品云萝卜2号杂交种基因组DNA；步骤2，以步骤1所提取的云萝卜2号杂交种基因组DNA作为模板，采用上述SSR引物SSR06进行PCR扩增；步骤3，将步骤2中的扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果；步骤4，利用步骤3的统计结果计算云萝卜2号杂交种的纯度。发明专利技术提供的SSR引物SSR06特异性高，鉴定结果准确；且本发明专利技术的鉴定方法，能快速、准确、便捷的鉴定杂交种子的纯度，克服了田间小区种植鉴定杂交种纯度费时、费力的缺点。

A SSR primer and method for identification of hybrid seed purity of yunradish No.2

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的SSR引物及方法
本专利技术涉及杂交种子纯度鉴定
，尤其涉及一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的SSR引物及方法。
技术介绍
萝卜(RaphanussativusL.)为十字花科(Brassi-caceae)萝卜属(Raphanus)蔬菜，在中国常年栽培面积仅次于大白菜，在农业生产中占有重要地位。萝卜的种植区域广泛，种植品种多，干制加工型萝卜是秋冬季云南山区重要的特色农业支柱产业，依托云南独特的气候优势得以迅速发展。据统计，2018年云南省萝卜种植面积约为110万亩，主要种植于曲靖、昭通、楚雄、红河等地区。近年来随着云南省加工型萝卜条的外销和出口产值不断提高，对加工型萝卜的条形和品质也提出了更高的要求，选育出产量高、品质优的加工型萝卜品种也变得更为迫切。云萝卜2号是云南省农业科学院园艺作物研究所选育运用雄性不育技术获得的杂交一代干制加工型萝卜品种，具有肉质根皮、肉白色、根型长直、干物质含量高、抗病性强、加工品质优良等优点，已在云南省楚雄州、红河州、陆良县等干制加工基地规模化推广种植，随着该品种种植面积的不断扩大，种子需求量和制种面积也相应增加。云萝卜2号杂交种生产过程中，父母本按照一定比例分行种植，并与其他品种或者类型的十字花科作物保持2000m以上的隔离距离；母本植株开花后拔出混杂的可育株，利用昆虫等传粉媒介或者人工辅助授粉的方式，获得杂交种子。但制种时母本中可育株未完全去除、田间隔离措施不完善、收获前父本没有及时拔出、收获后其他品种混入都会导致假杂种的产生。目前田间小区种植鉴定是干制加工型萝卜种子纯度鉴定的主要手段，存在工作量大、周期长、易受经验和环境影响等缺点，可能错过杂交种最佳的销售和播种时间。因此，寻找一种准确、快速的鉴定杂交种纯度的方法是非常重要的，有利于云萝卜2号的进一步推广应用。
技术实现思路
为了解决上述相关领域中的不足，本专利技术提供一种用于云萝卜2号杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR06及其鉴定方法。本专利技术的一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的SSR引物及方法是通过以下技术特征实现的：一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的SSR引物，其特征在于，所述SSR引物为SSR06，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。引物SSR06的上游引物和下游引物的具体单链DNA序列从5’到3’端分别为：上游引物：GAAGCAGATGATTGCAAAACC(SEQIDNO:1)；下游引物：CATCCGTTTTGAAGATGGAAA(SEQIDNO:2)。一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1，提取待测样品云萝卜2号杂交种基因组DNA；步骤2，以步骤1所提取的云萝卜2号杂交种基因组DNA作为模板，采用所述SSR引物SSR06进行PCR扩增；步骤3，将步骤2中的扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果；步骤4，利用步骤3的统计结果计算云萝卜2号杂交种的纯度。进一步地，步骤1采用CTAB法提取云萝卜2号父本材料WR01、母本材料WS01，杂交种F1的叶片基因组DNA。进一步地，步骤3扩增产物的检测包括：步骤i，将步骤2的扩增产物中加入2μL上样缓冲液，经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，每个样孔点2μL，DL50DNAMarker为对照，180V恒压下电泳90min；步骤ii，电泳结束后，将凝胶剥下在固定液中浸泡10min，取出用双氧水冲洗一次，在0.1％AgNO3溶液中银染10min，取出用双氧水快速冲洗2次，随后浸泡在于显影液显影10min，直至可以观察到DNA条带；步骤iii，立即用双氧水漂洗，平铺放在观察灯上统计带型并拍照编号保存；步骤v，比较云萝卜2号杂交种及其双亲的特征谱带，表现共显性互补带型为云萝卜2号杂交种，只有亲本带型的为非杂交种，出现其他第三种带型的为外来杂种。进一步地，所述云萝卜2号杂交种的纯度是通过以下方式进行计算的：送检测云萝卜2号纯度(％)＝(总检测种子粒数-非杂交种数-外来杂交种数)/总检测种子粒数×100％。进一步地，步骤2中PCR扩增时，反应体系包括:10μL2×TaqplusmastermixII，7μLddH20，1μL模板DNA，上游引物SSR06-F和下游引物SSR06-R各1μL。进一步地，步骤2中PCR扩增时的PCR反应程序为：95℃预变性5min；30个扩增循环，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min25s；72℃延伸5min。进一步地，步骤1中提取云萝卜2号父本材料WR01、母本材料WS01，杂交种F1的叶片基因组DNA的步骤包括：步骤a，取幼嫩叶片100mg放入1.5mL离心管中，加入液氮用研磨棒研磨，加200μL2％CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至700μL，65℃水浴40min；步骤b，加入氯仿和异戊醇共700μL，其中V氯仿：V异戊醇＝24:1，轻摇5min，后12000rpm离心10min；步骤c，取250μL上清，加入250μL预冷的异丙醇混匀，-20℃放置冷藏30min；12000rpm离心10min；弃上清，加入150μL预冷乙醇，轻轻混匀，12000rpm离心5min；弃上清，晾干或吹干；步骤d，加100μLTE溶解DNA，室温放置1h；步骤e，用TE将DNA稀释到50ng/μL后作为PCR模板使用或-20℃冷藏保存备用。进一步地，所述固定液为0.02％冰醋酸和99％酒精混合液。进一步地，所述显影液为3％NaOH与0.5％甲醛混合液。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1)本专利技术中的SSR引物SSR06特异性高，标记重复性好，条带清晰，能够准确鉴定云萝卜2号干制加工型萝卜杂交种子的纯度；2)该检测方法快捷、简便、稳定、可靠、成本低，可在3-4h之内完成云萝卜2号种子纯度鉴定工作，有利于云萝卜2号杂交种高效准确的质量控制。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。图1为部分设计引物在云萝卜2号亲本间进行筛选获得条带的情况，其中SSR06引物在云萝卜2号亲本间可获得特异性条带；图2为利用本专利技术检测云萝卜2号干制加工型萝卜杂交种及其父母本获得的特异性条带；其中M表示Marker，P1为云萝卜2号父本，P2为云萝卜2号母本，F1表示100份已检测云萝卜2号杂交种中的部分检测结果(三角形所示为云萝卜2号假杂交种样品)；图3为利用本专利技术检测1号制种基地生产的云萝卜2号干制加工型萝卜杂交种及其父母本获得的特异性条带；其中M表示Marker，P1为云萝卜2号父本，P2为云萝卜2号母本，F1表示100份已检测云萝卜2号杂交种中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的SSR引物，其特征在于，所述SSR引物为SSR06，包括上游引物和下游引物；/n所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的SSR引物，其特征在于，所述SSR引物为SSR06，包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.一种利用权利要求1所述SSR引物鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1，提取待测样品云萝卜2号杂交种基因组DNA；
步骤2，以步骤1所提取的云萝卜2号杂交种基因组DNA作为模板，采用所述SSR引物SSR06进行PCR扩增；
步骤3，将步骤2中的扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果；
步骤4，利用步骤3的统计结果计算云萝卜2号杂交种的纯度。


3.如权利要求2所述的一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的方法，其特征在于，步骤1采用CTAB法提取云萝卜2号父本材料WR01、母本材料WS01，杂交种F1的叶片基因组DNA。


4.如权利要求2所述的一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的方法，其特征在于，步骤3扩增产物的检测包括：
步骤i，将步骤2的扩增产物中加入2μL上样缓冲液，经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，每个样孔点2μL，DL50DNAMarker为对照，恒压下电泳一段时间；
步骤ii，电泳结束后，将凝胶剥下在固定液中浸泡一段时间后取出用双氧水冲洗一次，在0.1％AgNO3溶液中银染一段时间后取出用双氧水快速冲洗数次，随后浸泡在于显影液进行显影，直至可以观察到DNA条带；
步骤iii，立即用双氧水漂洗，平铺放在观察灯上统计带型并拍照编号保存；
步骤v，比较云萝卜2号杂交种及其双亲的特征谱带，表现共显性互补带型为云萝卜2号杂交种，只有亲本带型的为非杂交种，出现其他第三种带型的为外来杂种。


5.如权利要求2所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶婧，李石开，孙一丁，汪骞，袁艺，钟秋月，
申请(专利权)人：云南省农业科学院园艺作物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53