人类BCR-ABL基因T315I突变检测与分析制造技术

本发明专利技术提供了一种用于用于人类BCR/ABLT315I突变的试剂盒及其制备方法和用途。所述试剂盒的应用，对CML和Ph+ALL耐药性的筛查及临床科学用药具有指导意义，其中BCR‑ABL融合基因的ABL T315I突变在临床上被用作CML和Ph+ALL药物治疗指导的主要指针。

Detection and analysis of T315I mutation in human bcr-abl gene

【技术实现步骤摘要】
人类BCR-ABL基因T315I突变检测与分析
本专利技术涉及分子生物学领域的基因检测技术，尤其涉及人类BCR-ABL基因T315I突变检测与分析，提供了用于人类BCR/ABLT315I突变的试剂盒。
技术介绍
费城染色体是由9号和22号染色体相互易位形成t(9；22)(q34；q11)，其编码一种异常蛋白质“BCR-ABL”融合蛋白。由于9号染色体ABL断裂点不同，产生三种融合基因，编码三种不同分子量的融合蛋白P190，P210，P230。其中，95％的慢性髓细胞白血病(chronicmyelogenousleukemia，CML)和20％～40％急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)都可检测到特征性的Ph染色体及其分子标志BCR-ABL融合基因。CML是一种造血系统的恶性增殖性疾病，其全球发病率是1.6/10万人，我国的发病率为0.39-0.55/10万人，本病可见于各年龄组，我国CML的患者较西方更为年轻化，西方国家的中位发病年龄是67岁，国内的几个地区的流行病调查显示CML的中位发病年龄是45～50岁。男性高于女性，男女之比为3：2。ALL是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病，其发病率约为0.67/10万。在油田、污染区发病率明显高于全国发病率。ALL儿童期(0～9岁)为发病高峰，可占儿童白血病的70％以上。ALL在成人中占成人白血病的20％左右。伊马替尼(Imatinib)为代表的BCR-ABL抑制剂是治疗慢性髓细胞性白血病(CML)和Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)的一线靶向药物，伊马替尼靶向治疗之后，中位生存期由原来3-4年延长到10年(见表1)。但如果治疗中BCR-ABL融合基因发生突变，则表现出治疗抗性。在TKI耐药或复发的患者中发现100多种BCR-ABL基因的突变，不同基因位点的突变所导致的耐药程度不同。当TKI的剂量增加或者更换第二代TKI时，临床上大多数的突变型患者对上述改变有效，但具有BCR/ABLT315I突变的患者对上述药物均无效。仅第三代Bcr-Abl激酶靶向抑制剂Ponatinib，对T315I突变型Bcr-Abl激酶具有高效特异性抑制作用。以上事实表明，本项目将利用人类基因、遗传学及基因组学最新研究成果和当代生物技术的最新手段及仪器设备，开发一个用于检测与分析BCR/ABLT315I基因突变的试剂盒，对CML和Ph+ALL耐药性的筛查及临床科学用药具有重要的指导意义。表1不同治疗手段进行比较
技术实现思路
本专利技术提供了人类BCR-ABL基因T315I突变检测与分析，提供了一种用于检测人类BCR-ABL基因T315I突变的试剂盒。所述用于检测人类BCR-ABL基因T315I突变的试剂盒包括：表2、试剂盒盒组成成分表名称成分数量PCR反应液(mix)四对引物、四个探针、dNTPs、DNA聚合酶、MgCl2等1阴性质控水1标准品1102个拷贝数突变体质粒1标准品2103个拷贝数突变体质粒1标准品3104个拷贝数突变体质粒1标准品4105个拷贝数突变体质粒1标准品5106个拷贝数突变体质粒1标准品6107个拷贝数突变体质粒1所述试剂盒的用途包括：BCR-ABL融合基因的ABLT315I突变在临床上被用作CML和Ph+ALL药物治疗指导的主要指针，对CML和Ph+ALL耐药性的筛查及临床科学用药具有重要的指导意义。所述试剂盒的制备方法包括：分析BCR-ABL基因序列，结合ARMS-PCR方法的特点，选取含有突变位点的一段长132的序列作为扩增片段，设计引物及探针。为了增加该方法的敏感性，在引物的基础上增加非人源接头序列，并且采用非人源接头序列，扩增人源的模板序列时，只有遇到非人源序列才能扩增，这样的设计极大的避免错配的出现。除此之外，需对每个样本提供一个参照基因扩增反应，用于估测样本实际DNA的浓度。各引物及探针见表3。表3、引物及探针附图说明有关本专利技术的上述简要介绍以及下述的详细描述，结合附图会得到更好的理解。图1示意性描述了本专利技术一种实施方式的产品技术路线。图2是本试剂盒提供的标准品的扩增曲线图。图3是本试剂盒提供的阳性和阴性样品的扩增曲线图。图4是本试剂盒提供的阳性和阴性样品的扩增曲线图。具体实施方式人类BCR/ABLT315I基因的突变检测与分析是利用扩增阻滞突变原理测定可准确检测出含量低至0.5％的突变DNA，即为仅混有100拷贝的突变体就可以检测出来；特异性检测在较高拷贝的野生质粒背景下，仍然未有假阳性的出现。BCR-ABL融合基因的ABLT315I突变在临床上被用作CML和Ph+ALL药物治疗指导的主要指针，对CML和Ph+ALL耐药性的筛查及临床科学用药具有重要的指导意义。伊马替尼(Imatinib)为代表的BCR-ABL抑制剂是治疗CML和Ph+ALL的一线药物。对于BCR-ABL抑制剂治疗，已知虽然在CML和Ph+ALL的进展期很多患者有良好应答，但如果治疗中BCR-ABL融合基因发生突变，则表现出治疗抗性。在TKI耐药或复发的患者中发现100多种BCR-ABL基因的突变，不同基因位点的突变所导致的耐药程度不同。当TKI的剂量增加或者更换第二TKI时，临床上大多数的突变型患者对上述改变有效，但具有BCR/ABLT315I突变的患者对上述药物均无效，仅第三代Bcr-Abl激酶靶向抑制剂Ponatinib，对T315I突变型Bcr-Abl激酶具有高效特异性抑制作用。因此，对于CML和Ph+ALL患者，需要定时对BCR/ABLT315I突变进行简单准确地检测。本专利技术提供的检测手段利用人类基因、遗传学及基因组学最新研究成果和当代生物技术的最新手段及仪器设备，提供用于检测与分析BCR/ABLT315I基因突变的试剂盒。本产品利用扩增阻滞突变原理方法能够快速、准确地测定BCR/ABLT315I的突变信息，为CML和Ph+ALL耐药性的筛查及临床科学用药提供科学依据，从而提高治疗水平。本试剂盒首先利用扩增阻滞突变原理(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)，在目的片段的突变位点处设计ARMS特异性引物，该引物的3’末端碱基必须与突变目的片段相匹配。与此同时，人为的在引物3’末端突变位点处再引入一个错配碱基，这样才能极大提高ARMS引物的特异性。其次，在ARMS特异性引物的基础上，增加非人源接头序列，富集ARMS法扩增的突变目的片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于人类BCR/ABLT315I突变的试剂盒，包括PCR反应液、标准品、阴性质控，其中，所述PCR反应液包括：四对引物、四个探针、dNTPs、DNA聚合酶、MgCl

【技术特征摘要】
1.一种用于人类BCR/ABLT315I突变的试剂盒，包括PCR反应液、标准品、阴性质控，其中，所述PCR反应液包括：四对引物、四个探针、dNTPs、DNA聚合酶、MgCl2。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述引物和探针包括：





3.权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括：分析BCR-ABL基因序列，结合ARMS-PCR方法的特点，选取含有突变位点的一段长132的序列作为扩增片段，设计引物及探针。


4.权利要求1所述试剂盒的用途，包括：对CML和Ph+ALL耐药性的筛查及临床科学用药具有指导意义，其中BCR-ABL融合基因的ABLT315I突变在临床上被用作CML和Ph+ALL药物治疗指导的主要指针。


5.权利要求1所述试剂盒的测试方法，包括：
1)将试剂盒内所有组分冰上融化，混匀并短暂离心，置于冰上；
2)往含有样品的PCR反应管加入反应液，反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟建，韩国英，
申请(专利权)人：山东宜尔森生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37