一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用。本发明专利技术对双孢蘑菇序列进行分析，得到了人类同源U6启动子序列，并构建了能高效表达Cas9蛋白和gRNA的CRISPR/Cas9载体，建立了一套对双孢蘑菇基因进行精确编辑的基因编辑体系。本发明专利技术的试验结果表明，本发明专利技术所建立的双孢蘑菇基因编辑体系能够成功高效的对双孢蘑菇基因

A method for gene editing of Agaricus bisporus and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用
本专利技术涉及一套用于双孢蘑菇的基因编辑系统及其应用。
技术介绍
双孢蘑菇（Agaricusbisporus）又称白蘑菇、口蘑等，是世界上人工栽培最广泛、产量和消费量最大的食用菌，也是我国最大的出口创汇食用菌。双孢蘑菇子实体富含蛋白质以及18种氨基酸，其中8种是人体必需氨基酸，其味道鲜美，低脂低热，被冠以“植物肉”的美誉风靡世界。目前，根据国际蘑菇科学学会（TheInternationalSocietyforMushroomScience，ISMS）统计，双孢蘑菇是目前世界上栽培面积最广的蘑菇之一，全球双孢蘑菇的总产量为483万吨，其中我国双孢蘑菇产量为250.5万吨，位居世界第一，同时也占同期国内食用菌总产量的7.2%。国内食用菌产业主要以木腐菌为主，对木料的需求较大，造成了严重的环境压力也制约了行业的发展。双孢蘑菇可以利用秸秆等草本原料进行栽培，环境需求低，适合大规模工厂化生产，因此，双孢蘑菇的产业发展和推广在我国具有巨大的潜力。然而，我国双孢蘑菇产业现在正面临着大而不精的问题，产量大但单位产量距离国际水平仍有很大差距。其原因之一便是菌种质量不高，如何获得适应国内生产环境的优质菌种是双孢蘑菇产业中一个十分重要的问题。因此，开发双孢蘑菇育种相关技术就具有重要意义。目前，在双孢蘑菇的育种方面，国内外主要都是采用杂交育种的方法对双孢蘑菇菌种进行改良，利用不育的同核体孢子进行杂交配对得到可育的异核体，以此筛选具有优良性状的杂交种。但双孢蘑菇产生独特的双孢担子，难以获得用于杂交的同核体孢子，因此限制了杂交育种在双孢蘑菇育种中的运用，并且杂交育种操作繁琐，生产周期长，定向性差，已经越来越难以满足现代双孢蘑菇的生产研发的需要。因此，利用基因编辑技术在基因组原位实现对基因的精确、定点、可遗传修饰，是目前双孢蘑菇进行遗传改良和育种的理想途径。目前主要的基因编辑工具有三种，分别是锌指核酸酶技术（ZincFingerNucleaseTechnology,ZFNs），转录激活因子样效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs）和CRISPR（ClusteredregμLarlyinterspacedshortpalindromicrepeats）基因编辑技术。其中TALENs和ZFNs技术需要构建复杂的识别蛋白，成本高昂，操作复杂，因此在大型真菌中难以广泛利用。而CRISPR/Cas9技术则只需合成一段与靶向DNA同源的20个碱基，插入这个载体并转入宿主细胞，转录所产生的gRNA就能介导Cas9蛋白切割宿主细胞的目标DNA，从而达到基因编辑的目的。近几年来，CRISPR/Cas9系统已成功应用于很多动物、植物和微生物遗传改良中，例如老鼠、线虫、斑马鱼、酵母、水稻、马铃薯等。在食用菌中，关于CRISPR/Cas9技术的应用仍未见成功报道，尤其是双孢蘑菇中未有CRISPR/Cas9技术的应，主要是因为以下几点问题：（1）缺乏有效的双孢蘑菇内源表达启动子，驱动gRNA和Cas9蛋白在双孢蘑菇菌丝内表达。（2）双孢蘑菇产生双孢担子，用传统的同源重组的方法通常不能得到纯合子，因此现有技术在双孢蘑菇育种方面有极大限制。（3）目前国内外还未有建立的双孢蘑菇的基因定点编辑技术。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术采用CRISPR/Cas9技术，经由RNA介导，无需构建复杂的识别蛋白具有简单方便、打靶精准度髙、构建成本低、对设计的多个位点进行定点编辑的各项优势。本研究探索了利用CRISPR/Cas9系统对双孢蘑菇基因组实施定点编辑的技术，搭建了双孢蘑菇基因组高效定点编辑的技术平台。本专利技术再有一个目的是提供一种用于双孢蘑菇的基因编辑方法。技术方案：为实现对双孢蘑菇进行基因编辑，本专利技术在第一方面提供了一种DNA基因组片段的基因编辑工具，为CRISPR/Cas9系统。所述CRISPR/Cas9系统包含一种用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体及针对目标DNA片段的一个或多个gRNA；将针对目标DNA片段的一个或多个gRNA编辑到用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体上。本专利技术第二方面提供方了一种用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体为将双孢蘑菇U6启动子、双孢蘑菇GPD基因启动子，gRNA的核苷酸序列装载或替换到pRGEB32载体上，得到用于编辑双孢蘑菇基因的重组载体；所述双孢蘑菇U6启动子序列如SEQIDNO:1所示。所述双孢蘑菇GPD基因启动子的序列如SEQIDNO:2所示。为了简化基因编辑后目标菌丝的鉴定工作，在重组载体中还包含抗潮霉素基因。本专利技术第三方面提供了用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体pAbGEB1在双孢蘑菇中进行基因编辑中的应用，CRISPR/Cas9载体转染双孢蘑菇菌丝，对双孢蘑菇菌丝的目的基因进行编辑，具体包括如下步骤：（1）构建由CRISPR/Cas9介导的植双孢蘑菇基因编辑载体，然后将构建好的CRISPR/Cas9载体转入农杆菌LBA4404，加入双孢蘑菇菌丝进行侵染；（2）将侵染后的菌丝放置于含有乙酰丁香酮的CM培养基上进行培养；（3）培养完成后得到的菌丝转移至含有潮霉素和特美汀的MMP初筛培养基进行初筛培养；（4）将初筛培养得到的菌丝转接到含有潮霉素的MMP复筛培养基进行复筛；（5）筛选转化阳性菌丝，获得定向编辑的双孢蘑菇突变菌丝；（6）对生物细胞基因组中有效的编辑基因进行qRT-PCR分析。将本专利技术的基因编辑工具对双孢蘑菇的AbPPO4基因进行编辑。即将上述CRISPR/Cas9载体转转化到双孢蘑菇菌丝内，对双孢蘑菇AbPPO4基因进行编辑。本专利技术利用上述gRNA介导的CRISPR/Cas9载体，所述载体通过以下方法制得：以PAbU6:gRNAscaffold元件替换pRGEB32中的RiceU3promoter:gRNAscaffold元件；再将两个双孢蘑菇GPD基因启动子分别连接Cas9基因及抗潮霉素基因，最后将靶向目标基因的gRNA插入pAbGEB1中的双孢蘑菇U6启动子与gRNAscaffold之间。所述的由CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体中，应用于CRISPR/Cas9载体的U6启动子。本专利技术鉴定出的双孢蘑菇U6启动子可以高效启动gRNA的转录。所述的由CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体中，GPD基因启动子驱动Cas9表达。所述的GPD基因启动子驱动Cas9表达是将扩增GPD启动子与权利要求9所得重组产物pAbGEB-V1分别进行NcoI和SbfI双酶切，双酶切后的载体片段与启动子片段经连接得到新在载体pAbGEB-V2。所述扩增GPD启动子是将克隆出的GDP启动子两端加上NcoI和SbfI接头形成，引物为：GPD-SbfI-F：GACCTGCAGGTAACT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA基因组片段的编辑工具，为CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9/n系统包含一种用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体及针对目标DNA片段的一个或多个gRNA；根据不同基因设计不同gRNA，并将一个或多个gRNA连接到用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体上。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA基因组片段的编辑工具，为CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9
系统包含一种用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体及针对目标DNA片段的一个或多个gRNA；根据不同基因设计不同gRNA，并将一个或多个gRNA连接到用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体上。


2.根据权利要求1所述的用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述的双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体为包括编码Cas9蛋白基因，双孢蘑菇U6启动子，双孢蘑菇GPD基因启动子，抗潮霉素基因在双孢蘑菇基因编辑体系中构建所得。


3.根据权利要求2所述的用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述双孢蘑菇U6基因与人类U6基因同源，双孢蘑菇U6启动子的序列如SEQIDNO:1所示。


4.根据权利要求3所述的用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述双孢蘑菇GPD基因启动子的序列如SEQIDNO:2所示。


5.采用权利要求1-4任一项所述的用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体在双孢蘑菇中进行基因编辑中的应用，其特征在于，CRISPR/Cas9载体转化双孢蘑菇菌丝，对双孢蘑菇菌丝的目的基因进行编辑，具体包括如下步骤：
（1）构建由CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体，然后将构建好的CRISPR/Cas9载体转入农杆菌LBA4404，并对双孢蘑菇菌丝进行侵染；
（2）将侵染后的菌丝放置于含有乙酰丁香酮的CM培养基上进行培养；
（3）培养完成后得到的菌丝转移至含有潮霉素和特美汀的MMP初筛培养基进行初筛培养；
（4）将初筛培养得到的菌丝转接到含有潮霉素的MMP复筛培养基进行复筛；
（5）筛选转化阳性菌丝，获得定向编辑的双孢蘑菇突变菌丝；
（6）对双孢蘑菇基因组中有效的编辑基因菌丝进行PCR及qRT-PCR分析。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体的构建步骤包括如下：
（1）将双孢蘑菇U6启动子PAbU6与gRNAscaffold进行重叠PCR获得PAbU6:gRNAscaffold元件；
（2）以pRGEB32载体为骨架，将PAbU6:gRNAscaffold元件替换pRGEB32中的RiceU3promoter:gRNAscaffold元件，得到新的载体命名为pAbGEB-V1；
（3）将双孢蘑菇GPD基因启动子插入新的pAbGEB-V1载体，将双孢蘑菇GPD基因启动子替换pAbGEB-V1载体中的Pubi10启动子，得到新的载体命名为pAbGEB-V2；
（4）将双孢蘑菇GPD基因启动子插入新的pAbGEB-V2载体，将双孢蘑菇GPD基因启动子插入抗潮霉素基因HygR之前，得到用于编辑双孢蘑菇基因的重组载体，即为CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体，并命名新载体为pAbGEB1。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的双孢蘑菇U6启动子是与人类U6基因同源的双孢蘑菇U6基因启动子序列进行再克隆所得的序列，所述克隆过程中引物序列为：
U6-F：GACCTGCAGGTACCCCGTGTATG...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈祥陵，吕阳，王佩，韩少鹏，曾弓剑，周超，刘文，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42