一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用。本发明专利技术对双孢蘑菇序列进行分析，得到了人类同源U6启动子序列，并构建了能高效表达Cas9蛋白和gRNA的CRISPR/Cas9载体，建立了一套对双孢蘑菇基因进行精确编辑的基因编辑体系。本发明专利技术的试验结果表明，本发明专利技术所建立的双孢蘑菇基因编辑体系能够成功高效的对双孢蘑菇基因

A method for gene editing of Agaricus bisporus and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用
本专利技术涉及一套用于双孢蘑菇的基因编辑系统及其应用。
技术介绍
双孢蘑菇（Agaricusbisporus）又称白蘑菇、口蘑等，是世界上人工栽培最广泛、产量和消费量最大的食用菌，也是我国最大的出口创汇食用菌。双孢蘑菇子实体富含蛋白质以及18种氨基酸，其中8种是人体必需氨基酸，其味道鲜美，低脂低热，被冠以“植物肉”的美誉风靡世界。目前，根据国际蘑菇科学学会（TheInternationalSocietyforMushroomScience，ISMS）统计，双孢蘑菇是目前世界上栽培面积最广的蘑菇之一，全球双孢蘑菇的总产量为483万吨，其中我国双孢蘑菇产量为250.5万吨，位居世界第一，同时也占同期国内食用菌总产量的7.2%。国内食用菌产业主要以木腐菌为主，对木料的需求较大，造成了严重的环境压力也制约了行业的发展。双孢蘑菇可以利用秸秆等草本原料进行栽培，环境需求低，适合大规模工厂化生产，因此，双孢蘑菇的产业发展和推广在我国具有巨大的潜力。然而，我国双孢蘑菇产业现在正面临着大而不精的问题，产量大但单位产量距离国本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA基因组片段的编辑工具，为CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9/n系统包含一种用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体及针对目标DNA片段的一个或多个gRNA；根据不同基因设计不同gRNA，并将一个或多个gRNA连接到用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体上。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA基因组片段的编辑工具，为CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9
系统包含一种用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体及针对目标DNA片段的一个或多个gRNA；根据不同基因设计不同gRNA，并将一个或多个gRNA连接到用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体上。


2.根据权利要求1所述的用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述的双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体为包括编码Cas9蛋白基因，双孢蘑菇U6启动子，双孢蘑菇GPD基因启动子，抗潮霉素基因在双孢蘑菇基因编辑体系中构建所得。


3.根据权利要求2所述的用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述双孢蘑菇U6基因与人类U6基因同源，双孢蘑菇U6启动子的序列如SEQIDNO:1所示。


4.根据权利要求3所述的用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述双孢蘑菇GPD基因启动子的序列如SEQIDNO:2所示。


5.采用权利要求1-4任一项所述的用于双孢蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体在双孢蘑菇中进行基因编辑中的应用，其特征在于，CRISPR/Cas9载体转化双孢蘑菇菌丝，对双孢蘑菇菌丝的目的基因进行编辑，具体包括如下步骤：
（1）构建由CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体，然后将构建好的CRISPR/Cas9载体转入农杆菌LBA4404，并对双孢蘑菇菌丝进行侵染；
（2）将侵染后的菌丝放置于含有乙酰丁香酮的CM培养基上进行培养；
（3）培养完成后得到的菌丝转移至含有潮霉素和特美汀的MMP初筛培养基进行初筛培养；
（4）将初筛培养得到的菌丝转接到含有潮霉素的MMP复筛培养基进行复筛；
（5）筛选转化阳性菌丝，获得定向编辑的双孢蘑菇突变菌丝；
（6）对双孢蘑菇基因组中有效的编辑基因菌丝进行PCR及qRT-PCR分析。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体的构建步骤包括如下：
（1）将双孢蘑菇U6启动子PAbU6与gRNAscaffold进行重叠PCR获得PAbU6:gRNAscaffold元件；
（2）以pRGEB32载体为骨架，将PAbU6:gRNAscaffold元件替换pRGEB32中的RiceU3promoter:gRNAscaffold元件，得到新的载体命名为pAbGEB-V1；
（3）将双孢蘑菇GPD基因启动子插入新的pAbGEB-V1载体，将双孢蘑菇GPD基因启动子替换pAbGEB-V1载体中的Pubi10启动子，得到新的载体命名为pAbGEB-V2；
（4）将双孢蘑菇GPD基因启动子插入新的pAbGEB-V2载体，将双孢蘑菇GPD基因启动子插入抗潮霉素基因HygR之前，得到用于编辑双孢蘑菇基因的重组载体，即为CRISPR/Cas9介导的双孢蘑菇基因编辑载体，并命名新载体为pAbGEB1。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的双孢蘑菇U6启动子是与人类U6基因同源的双孢蘑菇U6基因启动子序列进行再克隆所得的序列，所述克隆过程中引物序列为：
U6-F：GACCTGCAGGTACCCCGTGTATG...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈祥陵，吕阳，王佩，韩少鹏，曾弓剑，周超，刘文，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42