一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法，所述方法至少包括以下步骤：将无菌纤维素薄膜贴合在共培养固体培养基表面，然后将蛹虫草孢子悬液与含外源基因的农杆菌菌液等体积混合，涂布于无菌纤维素薄膜上，24℃恒温避光共培养48h后，将混合菌液连同纤维素薄膜转移至选择培养基，在贴合紧密的纤维素薄膜表面倒上一层选择培养基，22～25℃恒温避光培养；取穿透上层选择培养基的菌丝转接至传代培养基中，22～25℃恒温避光培养3～4d，筛选获得含外源基因的蛹虫草；本发明专利技术采蛹虫草外源基因遗传转化效率高达100％，成本低，操作简易。

A method of Agrobacterium mediated exogenous gene transfer into Cordyceps militaris cells

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法(一)
本专利技术涉及一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法。(二)
技术介绍
随着生命科学的蓬勃发展，分子生物学和基因工程技术也取得了长足的进步。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的外源基因转化方法，由于其可导入大片段DNA且导入基因拷贝数低，转化效率高，表达效果好，引起了科研工作者的广泛关注，同时由于具有对仪器和操作技术要求低的优势，被大量应用于植物和真菌基因工程中，用于研究未知基因功能，用于探索各种基因调控元件的机理等。目前，已经在根霉，曲霉，青霉等多种真菌中实现了农杆菌介导转化外源基因。蛹虫草(Cordycepsmilitaris(L.:Fr.)Fr.)，俗称北虫草，是北冬虫夏草的简称，也叫蛹虫草或蛹草，是虫草科，虫草属。主产于云南、吉林、辽宁、内蒙古等各地，可以通过寄生或者不寄生的方式得到蛹虫草真菌子实体，是研究虫草属的模式菌株。利用根癌农杆菌介导的蛹虫草转基因尚未有文献报道。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法，其特征在于所述方法至少包括以下步骤：/n将无菌纤维素薄膜贴合在共培养固体培养基表面，然后将蛹虫草孢子悬液与含外源基因的农杆菌菌液等体积混合，涂布于无菌纤维素薄膜上，24℃恒温避光共培养48h后，将混合菌液连同纤维素薄膜转移至选择培养基，在贴合紧密的纤维素薄膜表面倒上一层选择培养基，22～25℃恒温避光培养；取穿透上层选择培养基的菌丝转接至传代培养基中，22～25℃恒温避光培养3～4d，筛选获得含外源基因的蛹虫草；所述共培养固体培养基为IM+200mmol·L

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导外源基因导入蛹虫草细胞的方法，其特征在于所述方法至少包括以下步骤：
将无菌纤维素薄膜贴合在共培养固体培养基表面，然后将蛹虫草孢子悬液与含外源基因的农杆菌菌液等体积混合，涂布于无菌纤维素薄膜上，24℃恒温避光共培养48h后，将混合菌液连同纤维素薄膜转移至选择培养基，在贴合紧密的纤维素薄膜表面倒上一层选择培养基，22～25℃恒温避光培养；取穿透上层选择培养基的菌丝转接至传代培养基中，22～25℃恒温避光培养3～4d，筛选获得含外源基因的蛹虫草；所述共培养固体培养基为IM+200mmol·L-1乙酰丁香酮；所述选择培养基是IM+200mg·L-1潮霉素B+200mg·L-1头孢菌素+100mg·L-1卡那霉素；所述传代培养基是沙氏培养基+200mg·L-1潮霉素B。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛹虫草孢子悬液浓度为106～108·mL-1。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛹虫草孢子悬液按如下方法制备：将蛹虫草(Cordycepsmilitaris)接种至PDA培养基，24℃恒温避光培养7日，然后于超净工作台上用无菌水反复冲洗PDA培养基表面，得到蛹虫草菌悬液，过滤菌悬液除去菌丝体，得到蛹虫草孢子悬液。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含外源基因的农杆菌菌液OD600＝0.80。


5.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨胜利，杨锡，陈萍，孔潇慧，季小康，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33