一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，包括构建过表达4‑1BBL的K562细胞；构建过表达IL‑15的K562细胞；利用铯照射源照射细胞至细胞处于灭活状态；无菌条件下取健康人静脉血，离心收集外周血中的单个核细胞并进行扩大培养；取外周血单个核细胞与灭活的K562细胞、灭活的过表达4‑1BBL的K562细胞、灭活的过表达IL‑15的K562细胞共培养；利用CD56磁珠富集NK细胞。本发明专利技术方法操作简单，获得富含高杀伤活性的NK细胞群体，不含杂质细胞，避免了杂质细胞导致的免疫原性，临床应用副作用较小，适宜肿瘤患者的辅助治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法
本专利技术涉及细胞培养
，具体是一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法。
技术介绍
综合治疗是恶性肿瘤的重要治疗原则,除传统的化疗、放疗及手术等治疗方法外,免疫治疗的地位日益增强。自20世纪80年代，科学家发现淋巴因子激活的自体杀伤细胞(lymphokineactivatedkiller,LAK)经大剂量IL-2体外扩增后,可治疗恶性肿瘤,由此提出了过继性免疫细胞治疗肿瘤的概念。肿瘤免疫过继治疗中，NK细胞是重要的效应细胞，NK细胞因不需活化即具有细胞毒作用,且抗瘤谱较广而被广泛研究，体外实验证实NK细胞对多种肿瘤细胞具有杀伤作用。然而由于NK细胞的杀伤活性与IL-2的剂量高低、体内活化NK的数量及肿瘤表面MHC-I类抗原的表达高低有关,致使NK细胞在临床应用中的疗效不一，NK细胞杀伤活性对于肿瘤细胞的根除至关重要。研究表明,NK细胞表面有抑制性受体及活化性受体,通过调节其受体的表达可影响NK细胞的杀伤活性。因此,如何提高NK细胞的杀伤活性,提高NK细胞对表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：/na.载体构建：构建过表达4-1BBL和IL-15的载体；/nb.病毒包装：采用步骤a中构建的质粒包装慢病毒，检测病毒滴度；/nc.K562细胞的感染与制备：采用步骤b中的病毒对K562细胞进行感染，检测4-1BBL表达效率和IL-15表达效率；/nd.灭活K562细胞：采用X-ray照射K562细胞；/ne.收集单个核细胞：抽取健康人外周血，利用梯度离心方法富集外周血单个核细胞；/nf.预扩增自然杀伤性细胞：利用NK细胞培养基培养外周血单个核细胞，获得超过50%的NK细胞；/ng.采用步骤d中的K562细...

【技术特征摘要】
1.一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.载体构建：构建过表达4-1BBL和IL-15的载体；
b.病毒包装：采用步骤a中构建的质粒包装慢病毒，检测病毒滴度；
c.K562细胞的感染与制备：采用步骤b中的病毒对K562细胞进行感染，检测4-1BBL表达效率和IL-15表达效率；
d.灭活K562细胞：采用X-ray照射K562细胞；
e.收集单个核细胞：抽取健康人外周血，利用梯度离心方法富集外周血单个核细胞；
f.预扩增自然杀伤性细胞：利用NK细胞培养基培养外周血单个核细胞，获得超过50%的NK细胞；
g.采用步骤d中的K562细胞，体外刺激步骤f中的NK细胞活化和扩增；
h.利用CD56磁珠富集NK细胞。


2.根据权利要求1所述的一种高效体外扩增培养具有强杀伤力的自然杀伤性细胞的方法，其特征在于：步骤a中，表达4-1BBL的载体包括4-1BBL基因的CDS编码区，其中包含4-1BBL基因信号肽；表达IL-15的载体包括IL-15基因的CDS编码区，其中包含IL-15基因信号肽。


3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪晓敏，袁卫平，杨爽，袁胜男，初雅婧，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12