一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料制造技术

本发明专利技术提供了一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料，该荧光染料为基于萘酰亚胺，以三苯基膦为定位基团设计合成的一种能够对活细胞线粒体快速、准确标记的荧光染料。通过在供电子一端引入氮杂环丁烷，一定程度上抑制了染料的TICT，使其在水中吸光度提高到15000M

A mitochondrial fluorescent dye with high brightness and stability

【技术实现步骤摘要】
一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料
本专利技术属于荧光染料和成像领域，具体涉及一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料。
技术介绍
线粒体是细胞能量产生和信号转导的枢纽，研究表明线粒体的代谢紊乱与包括阿尔兹海默症在内的多种疾病的发生发展有着密切联系。因此监测其形态及与多种细胞器的相互作用，对深刻理解复杂的细胞生命活动非常必要。光学显微镜因其原位无损的检测特点，在这类生命科学领域的研究中备受青睐。但是为了满足长时间观察线粒体动态这一需求，用于线粒体染色的荧光染料必须具备亮度高、稳定性强的性质。目前广泛使用的绿色商业线粒体染料为基于花菁染料的MitoTrackerGreen，花菁染料量子产率低且易被生物体内的单线态氧氧化而淬灭，光稳定性差，无法对活细胞内线粒体动态过程进行长时间示踪。因此，开发一种高亮度、高光稳定性荧光染料对于线粒体的长时间荧光成像以及超分辨成像显得尤为迫切。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高亮度、高稳定性适用于线粒体成像的荧光染料，一定程度上解决了商用线粒体定位荧光染料亮度、光稳定性不足的问题。具体结构以1,8-萘酰亚胺为基本单元，通过在萘酰亚胺的供电子一端引入氮杂环丁烷，一定程度上抑制了染料的TICT，从而提高了染料的亮度和稳定性。以三苯基膦为靶向基团，借助线粒体自身显负性的膜电位即可实现对线粒体的定位，从而达到借助荧光显微镜对线粒体进行长时间追踪与观察的目的，并可用于超分辨荧光成像领域。本专利技术一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料，其结构式如下所示：一种高亮度、高稳定性线粒体荧光成像染料的合成方法，合成路线如下：具体合成步骤如下：(1)中间体4-氮杂环丁烷-1,8-萘酐的合成将4-溴萘酐、无水硫酸铜、氮杂环丁烷溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，升温至110-120℃，反应8-12h后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到4-氮杂环丁烷-1,8-萘酐。(2)中间体N-乙胺基-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的合成化合物4-氮杂环丁基-1,8-萘酐溶于乙醇，向其中滴加二乙胺，缓慢升温70-85℃搅拌，反应8-12h后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-乙胺基-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐。(3)中间体N-(2-丁酰氯)-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的合成化合物N-乙胺基-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐及氯乙酰氯、三乙胺于二氯甲烷中，15-30℃下反应6-8h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(2-丁酰氯)-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐。(4)化合物Mito-AAze的合成化合物N-(2-丁酰氯)-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐、三苯基膦、碘化钾溶于乙腈，升温至120-140℃搅拌10-16h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到化合物Mito-AAze。步骤(1)中4-溴萘酐与无水硫酸铜的质量比为1:1-3，4-溴萘酐的质量与氮杂环丁烷的体积比为1:0.5-2g/mL，4-溴萘酐的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:5-20，氮杂环丁烷与N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:5-20。步骤(2)中4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的质量与乙二胺的体积比为1:0.5-5(mg:μL)，4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:50-200(g:mL)，乙二胺和乙醇的体积比为1:20-100。步骤(3)中N-乙胺基-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的质量与氯乙酰氯的体积比为1:1-4mg/μL，N-乙胺基-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的质量与三乙胺的体积比为1:0.5-10mg/μL，N-乙胺基-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的质量与二氯甲烷的体积比为1:50-300g/mL，氯乙酰氯与二氯甲烷的体积比为1:25-150。一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料在荧光成像、分子探针及荧光传感等领域的应用。本专利技术具有以下特征：该探针原料廉价易得，合成方法简单等优点。该探针在水中的量子产率达到0.34，吸光度达到15000M-1cm-1，相比于常规萘酰亚胺染料亮度明显提高，在HeLa、MCF等细胞中都能实现对线粒体的准确定位，适用于线粒体的超高分辨显微成像。该探针光稳定性相对于常见商业染料明显提高，500W钨灯照射10h后，荧光强度仍保持在起始值的97％。附图说明图1：实施例1制备得到的Mito-AAze的核磁氢谱；图2：实施例1制备得到的Mito-AAze的核磁碳谱；图3：实施例1制备得到的Mito-AAze的高分辨质谱；图4：实施例1制备得到的Mito-AAze在不同溶剂中的归一化荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；图5：实施例1制备得到的Mito-AAze在不同溶剂中的归一化紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；图6：实施例1制备得到的Mito-AAze于常见荧光染料光稳定性测试图，横坐标为测试时间，纵坐标为荧光强度相对值，荧光探针的浓度为10μM；图7：实施例1制备得到的Mito-AAze标记的宫颈癌细胞(HeLa)线粒体共聚焦成像图；图8：实施例1中制备得到的Mito-AAze标记的HeLa细胞线粒体结构光照明显微成像图。图9：实施例1中制备得到的Mito-AAze标记的线粒体与红色荧光蛋白标记的自噬小泡用于长时间观察HeLa的线粒体自噬活动的共定位图。具体实施方式实施例1.线粒体探针Mito-AAze的合成。中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的合成：4-溴萘酐(1g,3.6mmol)，无水硫酸铜(2g,12.5mmol)置于25ml的二口烧瓶中，氮气置换三次，在氮气保护下加入氮杂环丁烷(725μL,10.84mmol)及8mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺。加热至120℃反应8h，停止加入冷却至室温，将反应液缓慢倒入冰水中洗出粗产物。抽滤，滤饼真空烘干。用适量二氯甲烷及甲醇混合溶解粗产物，加入适量硅胶吸附后真空旋干，硅胶柱层析。洗脱液极性：二氯甲烷：石油醚由1:2梯度变化至纯二氯甲烷。洗脱液真空旋干后得橙色固体粉末373mg，产率为41％。其高分辨质谱数据如下：HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：254.0817，实验值：254.0883。经检测，其产物结构为4-氮杂环丁基-1,8-萘酐。中间体N-乙胺基-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的合成取4-氮杂环丁基-1,8-萘酐(126mg，0.5mmol)于圆底烧瓶中，向其中加入乙二胺(334μL，5mmol)及10ml乙醇，85℃下反应8h。硅胶板层析显示反应物反应完全，真空旋干反应液。用适量二氯甲烷及甲醇混合溶解粗产物，加入适量硅胶吸附后真空旋干，硅胶柱层析。洗脱液极性为二氯甲烷：甲醇＝50:1(V/V)，。洗脱液真空旋干后得橙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料，其特征在于：其结构式如下所示，/n

【技术特征摘要】
1.一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料，其特征在于：其结构式如下所示，





2.如权利要求1所述一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料的合成方法，其特征在于：具体合成步骤如下：
(1)中间体4-氮杂环丁烷-1,8-萘酐的合成
将4-溴萘酐、无水硫酸铜、氮杂环丁烷溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，升温至110-120℃，反应8-12h后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到4-氮杂环丁烷-1,8-萘酐；
(2)中间体N-乙胺基-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的合成
化合物4-氮杂环丁基-1,8-萘酐溶于乙醇，向其中滴加二乙胺，缓慢升温70-85℃搅拌，反应8-12h后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-乙胺基-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐；
(3)中间体N-(2-丁酰氯)-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的合成
化合物N-乙胺基-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐及氯乙酰氯、三乙胺于二氯甲烷中，15-30℃下反应6-8h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(2-丁酰氯)-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐；
(4)化合物Mito-AAze的合成
化合物N-(2-丁酰氯)-4-氮杂环丁基-1,8-萘酐、三苯基膦、碘化钾溶于乙腈，升温至120-140℃搅拌10-16h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到化合物Mito-AAze。


3.如权利要求2中所述的一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料的合成方法，其特征在于：步骤(1)中，4-溴萘酐与无水硫酸铜的质量比为1:1-3，4-溴萘酐的质量与氮杂环丁烷的体积比为1:0.5-2g/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，刘文娟，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21