犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒及其应用。本发明专利技术通过比对分析GenBank中已登录的23株犬瘟热病毒全基因组序列，根据犬瘟热病毒Fsp基因的保守序列设计了一对通用检测引物。同时对纳米PCR反应的退火温度、引物浓度进行了优化。灵敏度和特异性实验结果表明，本发明专利技术的纳米PCR检测方法的最低检测量为3×10

Detection kit of canine distemper virus by nano PCR and its application

【技术实现步骤摘要】
犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种病毒检测试剂盒，特别涉及一种用于犬瘟热病毒检测的纳米PCR检测试剂盒及其应用。本专利技术属于生物

技术介绍
犬瘟热(CanineDistemper,CD)是由犬瘟热病毒(CanineDistemperVirus,CDV)感染犬、狐貉和水貂等食肉动物而引起的一种急性热性、高度接触性传染病。该病发病率高，临床症状多样，感染后期容易继发混合感染，死亡率高达30％-100％。近年来CDV自然感染宿主不断增多，随着人类对犬猫等宠物拥有数量的增多，犬瘟热病毒在给动物养殖业、生物多样化带来了极大损失和危害的同时，还威胁着社会公共安全。CDV是副黏病毒科麻疹病毒属成员，其基因组为单股负链不分节段RNA。从3’到5’端依次是3’端前导序列、核蛋白(N)基因、磷蛋白(P)基因、基质蛋白(M)基因、融合蛋白(F)基因、血凝素蛋白(H)基因、聚合酶蛋白(F)基因和5’尾随序列。其中，H基因是CDV野毒株分子流行病学调查的主要靶基因。基于H基因的多样性,CDV可分为Asia1、Asia2、Europe、Europeanwildlife、America-2、Arctic和America-1型(又称疫苗型)。目前我国流行毒株主要是Asia1，对CDV的控制，主要采取弱毒活疫苗免疫措施，但疫苗免疫失败的现象却时有发生，甚至引起一定范围疫情暴发。实际感染案例中，犬瘟热病毒感染存在3-9天的潜伏期，这期间内病毒排出量较低。因此，高效、特异和灵敏的快速检测犬瘟热病毒感染对于及时发现和控制CDV感染、蔓延及流行至关重要。传统的实验室诊断CDV方法有：病毒分离、免疫荧光、ELISA和PCR等方法。这些方法要么操作复杂，费时费力，要么敏感度不高。后来学者们建立的鉴别CDV强弱毒方法有：复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)，联合RT-PCR，RT-LAMP方法，SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法。但这些方法需要专业技能人员操作和专用仪器。纳米PCR技术是一种基于直径为1-100nm的胶体金颗粒缓冲液的新型PCR技术。纳米金具有良好的导热性和吸附DNA作用，能使PCR反应快速达到靶向温度，减少非特异性扩增。目前尚未有应用纳米PCR技术检测犬瘟热病毒的报道。本专利技术根据CDVFsp基因的保守区域建立了CDV纳米PCR检测方法，可用于临床和实验室CDV感染的检测与诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于犬瘟热病毒检测的纳米PCR检测试剂盒及其应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术通过比对分析GenBank中已登录的23株犬瘟热病毒全基因组序列，根据犬瘟热病毒Fsp基因的保守序列设计了一对通用检测引物Nano-F/Nano-R。同时对纳米PCR反应的退火温度、引物浓度进行了优化，确定了纳米PCR检测犬瘟热病毒的最佳退火温度54℃和最佳引物浓度0.5μL(10pmol/μL)。对纳米PCR的特异性和灵敏度进行了鉴定，结果表明，与普通PCR灵敏度3×102拷贝/μL相比，本专利技术的纳米PCR检测方法的最低检测量为3×101拷贝/μL，灵敏度提高了10倍。特异性检测结果表明，该本专利技术的纳米PCR检测方法只能针对犬瘟热病毒实现特异性扩增，而不能扩增犬副流感病毒、狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒和犬腺病毒I型II型。本专利技术提出的一种犬瘟热病毒的通用检测引物，所述的引物用于扩增犬瘟热病毒Fsp基因保守区域，所述的引物由正向引物和反向引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步的，本专利技术还提出了所述的通用引物在制备检测犬瘟热病毒试剂中的用途。更进一步的，本专利技术还提出了一种犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒，其中含有一对用于扩增犬瘟热病毒Fsp基因保守区域的通用检测引物，所述引物由正向引物和反向引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。其中，优选的，所述的犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒中还含有用于纳米PCR检测的试剂。其中，优选的，所述的用于纳米PCR检测的试剂包括2×NanoPCRBuffer以及TaqDNApolymerase。其中，优选的，所述的犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒中还含有标准品质粒，所述的标准品质粒是通过以下方法制备得到：提取CDV-3株病毒液的总RNA，合成第一链cDNA，以合成cDNA为模板，通过PCR扩增得到CDV-3的F基因，将纯化的F基因连接至pEASY-Blunt载体上，即得，其中，优选的，用于扩增F基因的引物由正向引物和反向引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。其中，优选的，使用本专利技术所述的犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒检测犬瘟热病毒时，按照以下步骤进行：(1)提取待测样本的总RNA，合成第一链cDNA；(2)以步骤(1)合成的cDNA为模板，采用用于扩增犬瘟热病毒Fsp基因保守区域的通用检测引物进行纳米PCR扩增；反应体系12μL：2×NanoPCRBuffer6μL，10μM正向引物以及反向引物各0.5μL，TaqDNApolymerase0.2μL，模板0.2μL，用双蒸水补足至12μL；反应条件：95℃2min，95℃20s、54℃20s、72℃15s，35cycles；(3)扩增结束后对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：本专利技术针对CDVFsp区域建立了犬瘟热病毒纳米PCR检测方法及其试剂盒，与常规PCR相比，犬瘟热病毒纳米PCR方法的最低检出量为3×101个拷贝，灵敏度是普通PCR的10倍。犬瘟热病毒纳米PCR方法具有高度特异性，对其他相关病毒无任何扩增，对犬瘟热病毒不同毒株均具有特异性扩增。因此，本专利技术建立的犬瘟热病毒纳米PCR检测方法为CDV检测提供了一种快速、高度灵敏和高度特异的检测方法，可用于临床诊断与实验室检测。附图说明图1为pBlunt-F的鉴定结果；M：DNAMarker15000，1：限制性内切酶KpnⅠandNotⅠ双切质粒pBlunt-F，2：质粒pBlunt-F。图2为退火温度和引物浓度的优化实验结果；A：不同退火温度优化，泳道1-5分别为52℃、54℃、56℃、58℃和60℃；B：不同引物浓度扩增结果，泳道1-3分别为0.5μL、1μL、1.；5μL；M：DL2000bpDNAmarker；图3为纳米PCR(A)和普通PCR扩增(B)灵敏度检测结果；M：DL2000bpDNAmarker：泳道1-8：含有107-100拷贝/0.2μL的模板pBlunt-F进行普通PCR(A)和纳米PCR(B)；图4为纳米PCR反应的特异性。泳道1-4是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬瘟热病毒的通用检测引物，其特征在于，所述的引物用于扩增犬瘟热病毒Fsp基因保守区域，所述的引物由正向引物和反向引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种犬瘟热病毒的通用检测引物，其特征在于，所述的引物用于扩增犬瘟热病毒Fsp基因保守区域，所述的引物由正向引物和反向引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.权利要求1所述的通用引物在制备检测犬瘟热病毒试剂中的用途。


3.一种犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒，其特征在于，含有一对用于扩增犬瘟热病毒Fsp基因保守区域的通用检测引物，所述引物由正向引物和反向引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.如权利要求3所述的犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒，其特征在于，还含有用于纳米PCR检测的试剂。


5.如权利要求4所述的犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的用于纳米PCR检测的试剂包括2×NanoPCRBuffer以及TaqDNApolymerase。


6.如权利要求3所述的犬瘟热病毒纳米PCR检测试剂盒，其特征在于，还含有标准品质粒，所述的标...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛向红，闫喜军，卜研，闫鸣昊，朱翔宇，赵建军，张海玲，赵传芳，胡博，王洋，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22