一种cfDNA野生型标准品及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种cfDNA标准品的制备方法，包括：1)对基因组DNA进行片段化，获得片段化的基因组DNA；2)纯化筛选1)中所述片段化的基因组DNA。本发明专利技术还提供了所述制备方法制得的cfDNA标准品及其在血液cfDNA检测中的应用。本发明专利技术提供的制备cfDNA标准品的制备方法简单易行且回收率高。通过该方法制得的标准品DNA片段的长度主要集中分布在160‑175bp的范围，与提取的血浆中cfDNA的大小分布接近，所建文库片段长度也更匹配，减少了过大片段和过小片段的影响，若用突变细胞系与野生细胞系的gDNA来混合制作cfDNA突变质控品，则可用于鉴定建库及测序方法的灵敏度。

A cfdna wild type standard and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种cfDNA野生型标准品及其制备方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体地涉及一种cfDNA标准品的制备方法。
技术介绍
Mandel与Metais于1948年首先在人血液样本中发现了细胞游离DNA的存在(cfDNA)(MandelP,MétaisP.Lesacidesnucléiquesduplasmasanguinchezl’homme[Thenucleicacidsofbloodplasmainhumans].CrhebdséancesAcadsci.1948；(142):241-243.)。三十年后发现，癌症病人的血清和血浆中cfDNA的浓度比健康人的要高(LeonSA,ShapiroB,SklaroffDM,YarosMJ.FreeDNAintheserumofcancerpatientsandtheeffectoftherapy.CancerRes.1977；(37):646-650.)。随后发现，前者含有肿瘤特异性的分子突变，提示源自肿瘤的cfDNA，即循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)，能够出现在血液循环中。cfDNA和ctDNA也被报道能够在患有膀胱癌、结肠癌和非小细胞肺癌的病人的尿液中被检测到。到目前为止，cfDNA的具体来源仍然不清楚。推测cfDNA通过正常或恶性细胞的凋亡或坏死得以释放。此外也有研究提供证据表明cfDNA的释放可能通过胞外囊泡如外泌体进行。近年来，基于cfDNA和ctDNA的液体活检技术发展迅速，包括对靶向的分子检测进行高通量测序、疾病监控、治疗效果的评价，以及未来可能的癌症检测。患者血液中含有游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)，含量与肿瘤的大小和分期有关，其中来源于肿瘤细胞的cfDNA(ctDNA)携带基因突变相关信息，可作为一种肿瘤标志物。液体活检克服了肿瘤组织取样有创伤，且受肿瘤部位、大小、患者情况限制的问题，可在疾病进程中随时获取，取样方便、微创。然而由于人体液中cfDNA的丰度很低，持续获取病人相关材料的难度非常大，这些新的技术平台的开发具有很大的挑战性。要将cfDNA和ctDNA的检测结果解释为具有临床意义的结果还需要精准的技术来实现高灵敏度和高特异性的测量。并且，在工作流程、样本采集或检测中存在限制的情况下，特别需要确保检测的临床相关性。同任何临床流程一样，cfDNA的样本处理需也需要质量有保证的技术和对照方法，包括全面的确证过程。cfDNA检测中的标准品对于解决这些问题起到了重要的作用。目前对cfDNA进行基因突变检测方法主要有数字PCR和二代测序。与数字PCR相比，二代测序不但能够检测未知基因序列和未知突变，更能够高通量地检测多个基因位点。市面上已有多种针对二代测序的商业化捕获探针组合，用户可根据不同研究目的进行搭配使用，一次测序便可获得上百个基因突变数据，大大节约珍贵的临床样本，随着二代测序技术的不断更新和测序价格的下降，应用也会越来越广泛。通过二代测序检测cfDNA微量基因突变需要有适合检测目的的cfDNA标准品，以评估测序方法的稳定性、精确度、和分析效果。早期的手段与近年的基于NGS的孕妇cfDNA分析鉴定得到的cfDNA的长度分布结果显示，cfDNA片段的长度非常突出地集中在167bp左右。cfDNA的标准品的长度通常集中分布在160-175bp。目前市场上商品化的cfDNA标准品较少。进口的cfDNA标准品(Horizon：https://www.horizondiscovery.com/)有多种突变基因cfDNA标准品出售，网上标价505美元一支，每支350ng，该产品是以基因编辑的人类细胞系gDNA通过机械打断片段化来模拟人体内cfDNA。国产的cfDNA标准品(安可济：http://www.accuragen.com.cn/portal/article/index/id/58.html)涵盖五种常见突变基因，该产品在DNA片段化过程中引入了酶切工艺，价格比进口标准品稍低但对用量极大的测序平台来说同样高昂，因此目前尚缺少成本低廉、片段长度分布相对集中的cfDNA标准品。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服目前缺少商品化的cfDNA标准品这一技术问题，提供了一种cfDNA标准品及其制备方法。本专利技术提供的cfDNA标准品制备方法简单易行，通过该方法制得的标准品DNA片段的长度主要集中分布在160-175bp的范围，与提取的血浆中cfDNA的大小分布接近，所建文库片段长度也更匹配，减少了过大片段和过小片段的影响，若用突变细胞系与野生细胞系的gDNA来混合制作cfDNA突变质控品，则可用于鉴定建库及测序方法的灵敏度。本专利技术一方面提供了一种cfDNA标准品的制备方法，包括：1)对基因组DNA进行片段化，获得片段化的基因组DNA；2)纯化筛选1)中所述片段化的基因组DNA。在一优选实施方案中，所述基因组DNA为人基因组DNA。在一优选实施方案中，所述人基因组DNA提取自人血液样本。在一优选实施方案中，所述人基因组DNA提取自人细胞系样本。在一优选实施方案中，所述人基因组DNA提取自不含基因突变的人的血液样本和/或细胞样本。在另一优选实施方案中，所述人基因组DNA提取自含有基因突变的人的血液样本和/或细胞系样本。在一优选实施方案中，含有所述基因组DNA的溶液的总体积为50–500μL；优选地为130μL。在一优选实施方案中，所述基因组DNA的总质量为1-5μg；优选地，为5μg；优选地，所述基因组DNA溶于无核酸酶溶剂，如无核酸酶水。在一优选实施方案中，所述片段化的方法为核酸酶酶切法片段化和/或超声打断；优选地，所述超声打断的温度为18-22℃，更优选地为20℃；优选地，所述超声打断的功率为30-75W，更优选地为50W；优选地，所述超声打断的工作比为2％-20％，更优选地为20％；优选地，所述超声打断的循环次数为50-200次，更优选地为200次；优选地，所述超声打断的处理时间为20-500秒，更优选地为330-370秒，进一步更优选地为330-350秒，最优选地为350秒；优选地，所述超声打断使用CovarisM220进行。在一优选实施方案中，2)中纯化筛选1)中所述片段化的基因组DNA的方法为使用固相可逆固定化(SolidPhaseReversibleImmobilization,SPRI)磁珠纯化；优选地，所述SPRI磁珠为购自贝克曼-库尔特公司的SPRISelect，货号为B23317、B23318或B23319。在一优选实施方案中，使用SPRI磁珠纯化1)中所述片段化的基因组DNA的方法包括以下步骤：(1)将1)中所述片段化的基因组DNA加入贝克曼-库尔特公司的SPRISelect悬液、孵育，所述贝克曼-库尔特公司的SPRISelect悬液与含有所述片段化的基因组DNA的溶液的体积比为0.9︰1-1.2︰1，优选地为1.0︰1-1.2︰1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种cfDNA标准品的制备方法，其特征在于，包括：1)对基因组DNA进行片段化，获得片段化的基因组DNA；2)纯化筛选1)中所述片段化的基因组DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种cfDNA标准品的制备方法，其特征在于，包括：1)对基因组DNA进行片段化，获得片段化的基因组DNA；2)纯化筛选1)中所述片段化的基因组DNA。


2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述基因组DNA为人基因组DNA。


3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述人基因组DNA提取自人血液样本和/或人细胞系样本；优选地，提取自人血液样本。


4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述人基因组DNA提取自不含基因突变的人的血液样本和/或细胞样本。


5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述人基因组DNA提取自含有基因突变的人的血液样本和/或细胞系样本。


6.根据权利要求1-5中任一项所述制备方法，其特征在于，含有所述基因组DNA的溶液的总体积为50–500μL；优选地为130μL；
和/或，所述基因组DNA溶于无核酸酶溶剂，如无核酸酶水；
和/或，所述基因组DNA的总质量为1-5μg；优选地，为5μg；
和/或，所述片段化的方法为核酸酶酶切法片段化和/或超声打断；
和/或，所述纯化筛选1)中所述片段化的基因组DNA的方法为使用SPRI磁珠纯化；优选地，所述SPRI磁珠为购自贝克曼-库尔特公司的SPRISelect。


7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述超声打断的温度为18-22℃，优选地为20℃；
和/或，所述超声打断的功率为...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱其军，叶真龙，张长正，庄园，章晶，
申请(专利权)人：上海细胞治疗集团有限公司，上海白泽医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31