【技术实现步骤摘要】
一种滚环复制重组载体、构建方法及应用
:本专利技术属于生物技术及植物学领域，更具体的说属于开发了一种滚环复制重组载体构建方法、重组载体及应用。
技术介绍
：利用植物进行异源蛋白表达是研究植物的通用研究技术，例如植物功能基因研究中通过使用模式植物(拟南芥、本氏烟)对非模式植物的未知基因进行表达从而验证其基因功能；利用植物反应器(菠菜、烟草)对某些药用蛋白进行表达并分离纯化目的蛋白。通过分子克隆方式获得具有稳定长期外源基因表达的转基因植物是进行异源蛋白表达的最好方式；但是因其载体构建复杂，转化程序时间长，耗时多(往往需要6-10个月)等因素影响，直接限制了该方法的使用；构建带有T-DNA插入区的瞬时表达载体是进行植物异源蛋白表达研究的备选方案，通过将构建完成的载体转化农杆菌后利用注射器直接侵染植物，可以使注射区域在一段时间内稳定持续的表达目的蛋白，该方法操作简单，时效性强，全部流程可能只需要10天左右即可完成；但是该方法也存在着一些固有缺陷，直接限制了该方法的使用：(1)持续时间短，蛋白的最长表达时间也仅能保持5-7天左右；(2...
【技术保护点】
1.一种滚环复制重组载体，其特征在于，所述的载体为pCambia0390-SPLCV
【技术特征摘要】
1.一种滚环复制重组载体，其特征在于，所述的载体为pCambia0390-SPLCVmAC2&4-mid，其核苷酸序列如SEQIDNO：15。
2.如权利要求1所述的滚环复制重组载体构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下方案：
步骤1：获得SPLCV基因序列；
将带有甘薯卷叶病毒表型的植株，通过液氮急冻研磨后利用CTAB法提取DNA，并利用该病毒的保守引物进行PCR引物扩增获得对应PCR产物；
步骤2：扩增获得SPLCV复制子蛋白相关基因序列SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR和SPLCV-IL；
基于步骤1所获得SPLCV基因序列设计引物扩增得SPLCV复制子蛋白相关基因序列SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR和SPLCV-IL；其中，SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR的尾端序列命名为T-SPLCV-XZ-nIR，其具体序列为：T-SPLCV-XZ-nIR(SEQIDNO：6)，在本方法构建的重组载体设计中作为终止子参与病毒复制蛋白的转录终止；
步骤3：构建定点突变载体T-mAC4；
对于AC4蛋白的提前终止定点突变方案为：将SPLCV基因组第183处碱基由T突变至A，对应AC1氨基酸保持为异亮氨酸不变，对于AC4的氨基酸由苯丙氨酸变为终止子从而打断AC4蛋白的翻译；
步骤4：构建突变载体T-mAC2MmAC4；
在步骤3获得的T-mAC4质粒基础上进行AC2突变，对于AC2蛋白的提前终止定点突变方案为：在SPLCVAC4核苷酸第1034bp处碱基由A突变至T，对应AC1氨基酸由谷氨酸突变至缬氨酸，对于AC2的氨基酸由异亮氨酸突变变为终止子从而打断AC2蛋白的翻译；
步骤5：构建双定点突变重组载体pCambia0390-SPLCVmAC2&4-mid；
利用引物组合pCa-SPLCVUTR1F/pCa-SPLCVUTR1R对步骤4所得载体T-mAC4&T-mAC2进行扩增，将PCR扩增获得的PCR产物纯化以及步骤2所得SPLCV-IL纯化产物利用同源重组技术连接预先利用HindIII/BamHI酶切后的pCambia0390上，转化大肠杆菌DH5a，并筛选阳性克隆后，摇菌提取对应质粒；对应质粒命名为pCambia0390-SPLCVmAC2&4-mid。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤2的2对带接头引物为：
pCa-SPLCVIL1F:atgttgggcccggcgcgccatttgctgacgtatgcaatgggt(SEQIDNO：7)
pCa-SPLCVIL1R:ggggatcCtgcagccaagcttcttggcggccaagactggaa(SEQIDNO：8)
pCa-SPLCVUTR1F:aagaggagtccacCATGGTAtaaaatttgtttttattaatacagtaatac(SEQIDNO：9)
pCa-SPLCVUTR1R:agcgttaacactagtcagatctcttggcggccaagactggaaca(SEQIDNO：10)...
【专利技术属性】
技术研发人员：余益成，孙健，李宗芸，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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