一种高油抗逆牡丹选育方法技术

本发明专利技术公开了一种高油抗逆牡丹选育方法，该方法包括初选、复选、丰产性筛选以及高油、抗性基因遗传稳定性筛选，大大缩短选育周期，精准提升育种效率。尤其是基于启动子环境胁迫响应功能元件序列的筛选方法更真实、精准和可靠；并且本发明专利技术通过先克隆抗逆基因启动子再克隆功能元件特征序列避免了由基因组DNA直接克隆所带来的假阳性风险。

A breeding method of high oil and stress resistant Peony

【技术实现步骤摘要】
一种高油抗逆牡丹选育方法
本专利技术涉及木本植物培育领域，具体而言，涉及一种高油抗逆牡丹选育方法。
技术介绍
我国油质油料对外依存度高达70％，而粮食生产必须保护18亿亩基本农田，发展不与粮争地的木本油料成为唯一选择。核桃、油茶、油用牡丹等成为国家战略资源。油用牡丹抗逆性强适应性广，适合广袤大地露地和林下栽培，具有广阔发展前景。牡丹属于芍药科(Paeoniaceae)芍药属(PaeoniaL.)牡丹组(Sect.MoutanDC.)落叶灌木，共有8个种(洪德元,潘开玉.芍药属牡丹组的分类历史和分类处理[J].植物分类学报,1999(04):48-65)。其中，革质花盘亚组6种：①牡丹(P.suffruticosa)、②矮牡丹(P.jishanensis)、③卵叶牡丹(P.qiui)、④凤丹(杨山牡丹，P.ostii)、⑤紫斑牡丹(P.rockii)、⑥四川牡丹(P.decomposita)。肉质花盘亚组2种：⑦滇牡丹(P.delavayi)、⑧大花黄牡丹(P.ludlowii)，全部原产我国。园艺栽培品种牡丹(P.suffruticos本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高油抗逆牡丹选育方法，其特征在于，包括如下步骤(1)-(2)的任一项或两项：/n(1)高油基因遗传稳定性筛选/n以序列表中SEQ ID No.1-2、3-4、5-6、7-8和/或9-10所示的核苷酸序列为引物对牡丹ABI、WRI、SAD、FAD2和/或FAD3基因进行实时荧光定量RT-qPCR，检测表达量；/n(2)抗性基因遗传稳定性筛选/n以序列表中SEQ ID No.11-12、SEQ ID No.13-14和/或SEQ ID No.15-16所示的核苷酸序列为引物对DREB2A、WRKY19和/或XET基因启动子序列进行克隆；然后以该克隆为模板，以序列表中SEQ ID No.17...

【技术特征摘要】
1.一种高油抗逆牡丹选育方法，其特征在于，包括如下步骤(1)-(2)的任一项或两项：
(1)高油基因遗传稳定性筛选
以序列表中SEQIDNo.1-2、3-4、5-6、7-8和/或9-10所示的核苷酸序列为引物对牡丹ABI、WRI、SAD、FAD2和/或FAD3基因进行实时荧光定量RT-qPCR，检测表达量；
(2)抗性基因遗传稳定性筛选
以序列表中SEQIDNo.11-12、SEQIDNo.13-14和/或SEQIDNo.15-16所示的核苷酸序列为引物对DREB2A、WRKY19和/或XET基因启动子序列进行克隆；然后以该克隆为模板，以序列表中SEQIDNo.17-18、SEQIDNo.19-20和/或SEQIDNo.21-22为引物对抗逆基因启动子功能元件特征片段进行扩增并用于重组启动子植物表达载体的构建，将构建的重组启动子植物表达载体转入模式材料进行抗性响应鉴定。


2.根据权利要求1所述的高油抗逆牡丹选育方法，其特征在于，所述高油基因遗传稳定性筛选包括：
a.提取牡丹籽胚乳组织RNA，反转录获得cDNA序列；
b.以RT-qPCR方法对牡丹ABI、WRI、SAD、FAD2和/或FAD3基因扩增；RT-qPCR反应体系包括200ng/μlcDNA模板2μl，2×qPCRMasterMix10μl，10μlmol/L的上游引物和下游引物各0.8μl，50×ROXReferenceDyeII0.4μl，剩余量由ddH2O补齐，总体系25μl；反应条件为95℃，2min预变性；95℃，15s；60℃，60s，共40个循环；
c.荧光分析在65℃以0.5℃/s速度上升至95℃过程中进行，通过荧光分析检测牡丹籽油合成基因ABI、WRI、SAD、FAD2和/或FAD3的表达量，筛选表达量相对较高的牡丹品种作为高油牡丹。


3.根据权利要求1所述的高油抗逆牡丹选育方法，其特征在于，所述抗性基因遗传稳定性筛选包括：
a.DREB2A、WRKY19和/或XET基因启动子序列的克隆
提取牡丹基因组DNA；对DREB2A、WRKY19和/或XET基因启动子序列进行PCR扩增，所述PCR反应体系50μl，其中牡丹基因组DNA模板200ng，5U/μlTaKaRaLATaq0.5μl，10×LATaqBufferⅡ5μl，2.5mMeachdNTPMixture8μl，10pmol·μL-1上游引物1μl，10pmol·μL-1下游引物1μl，剩余由ddH2O补足；反应条件为1cycle：94℃，5min；35cycles：94℃，30s、52℃，30s、72℃，2min；1cycles：72℃，5min；将PCR产物克隆，提取质粒备用；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华芳，唐文思，修宇，李麟坤，彭正锋，杨金方，丁晶，丁钰，杨龙川，
申请(专利权)人：北京林业大学，江苏国色天香油用牡丹科技发展有限公司，北京网发地农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11