水稻转录因子基因OsBEAR1在培育胚芽鞘增长或适于田间直播的水稻品种中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一个调控水稻胚芽鞘生长发育基因

Application of rice transcription factor gene osbear1 in the cultivation of rice varieties with coleoptile growth or suitable for direct seeding in the field

【技术实现步骤摘要】
水稻转录因子基因OsBEAR1在培育胚芽鞘增长或适于田间直播的水稻品种中的应用
本专利技术属于生物
，涉及水稻胚芽鞘生长发育基因OsBEAR1及其应用。
技术介绍
水稻是人类重要的粮食作物，人们一直致力于追求简便、经济、高效的生产方式，水稻直播技术便是这高效栽培的重要一环。水淹是水稻直播的最重要的限制性因素，水淹会造成缺氧，而缺氧时细胞会产生和积累有毒物质，不利于水稻的萌发。很多水稻品种在淹水条件下成苗率会严重下降，从而限制了其在直播中的应用。胚芽鞘是植物的保护组织，保护胚芽在出土时不受伤害。同时，水稻胚芽鞘能够在缺氧环境中生长，对于水稻幼苗出水具有重要作用。生长发育快，更长的胚芽鞘对于淹水条件下的出苗率有着重要的意义，胚芽鞘快速生长可以使其尽快出水通气并向下供给氧气，减少细胞有毒物质的积累，提高水稻的出苗率。培育耐淹水、适合直播生产的水稻品种具有重要的经济与应用价值，而胚芽鞘生长快，具有更长胚芽鞘的品种往往更适合直播。近年来胚芽鞘方面国内外报道较少。因此，改造或培育长芽鞘的水稻品种，对于水稻生产具有重要意义。
技术实现思路
OsBEAR1，一个bHLH家族的转录因子，其编码的蛋白GenBank:ABA92524.1，通过基因编辑的方法在日本晴水稻中将该基因敲除，我们发现其胚芽鞘的生长发育加快并长于受体水稻。这对于改造或培育耐淹水、适合直播的品种提供了基础。本专利技术的目的是提供一个来源于水稻的转录因子基因OsBEAR1，在日本晴中将水稻OsBEAR1敲除后能够提高胚芽鞘的长度。本专利技术提供水稻转录因子基因OsBEAR1在培育胚芽鞘增长和/或适于田间直播的水稻品种中的应用，所述水稻转录因子基因OsBEAR1编码如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。本专利技术提供的水稻转录因子基因OsBEAR1（MSUID为LOC_Os11g15210），来源于水稻（Oryzasativa）,其基因全长序列如SEQIDNO：1所示，由2346个核苷酸组成；其基因编码区序列如SEQIDNO：2所示（LOC_Os11g15210.1），由1377个核苷酸组成；其编码蛋白质氨基酸序列如SEQIDNO：3所示，由458个氨基酸残基组成。所述的应用，其是下调或敲除水稻中所述水稻转录因子基因OsBEAR1的表达。所述的应用，所述敲除水稻中所述水稻转录因子基因OsBEAR1的表达，其中敲除针对的靶序列为：“5′-GGCTCTCGTCGACCGTATCA-3′（SEQIDNO：4）。同时本专利技术还提供一种培育胚芽鞘增长和/或适合田间直播的水稻品种的方法，该方法将水稻中的OsBEAR1基因进行敲除，经过筛选获得稳定可遗传的胚芽鞘增长的水稻植株。所述的方法，其是通过CRISPR方法编辑敲除所述基因；所述敲除针对的靶序列为：“5′-GGCTCTCGTCGACCGTATCA-3′（SEQIDNO：4）。进一步地，所述的方法，还包括收集遗传转化获得的T0代植株的种子播种获得T1代种子，通过测序验证获得纯合突变的敲除植株或种子。所述测序验证的方法是，提取T1代植株的基因组DNA，并用下述特异性引物进行PCR扩增并测序：F:CGTCGGGACTAGCTGAAA，R:ATTGCTCTGCCTAAACATACA。本专利技术还提供一种培育的水稻品种的方法，该方法将水稻中的OsBEAR1基因进行敲除，经过筛选获得稳定可遗传的胚芽鞘增长的水稻植株。本专利技术提供所述基因的CRISPR基因编辑重组载体。本专利技术提供所述基因（OsBEAR1）在培育胚芽鞘增长及适用于田间直播水稻品种中的应用。上述应用是利用CRISPR技术编辑敲除日本晴基因组中的目的基因OsBEAR1，获得所述基因功能缺失的胚芽鞘长于受体的水稻。实验表明，通过CRISPR技术将本专利技术所述的基因OsBEAR1敲除后，能够使敲除植物胚芽鞘的生长发育速率加快并长于受体植物，这有利于提高水淹条件下种子的萌发和出苗率。本专利技术为改造或培育其他耐水淹、合适直播的水稻品种提供了基础。附图说明图1.基因编辑植株PCR鉴定电泳图。图2.敲除植株靶位点的测序峰图。图3.敲除前后靶位点的序列比对图，图中sbjct表示原受体植物的参考序列，Query表示敲除植物的测序序列，如图所示，OsBEAR1基因敲除植物的基因组序列，在原参考序列的第821个碱基T后插入了一个A，这个碱基A的插入达到了该基因敲除的效果。图4.胚芽鞘表型图，图中WT表示未敲除的受体水稻，CRI-BEAR表示敲除后的水稻，图中每种材料各取了8棵，图中标尺为1cm。图5.胚芽鞘长度统计图，图中WT表示受体水稻，CRI-BEAR表示敲除水稻，该胚芽鞘的长度值为图4中8棵的平均值。具体实施方式下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本专利技术，但不是对本专利技术的限制，仅仅作示例说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂与药品，实验均设置三次重复以上，结果取平均值。实施例1：水稻OsBEAR1的敲除一、OsBEAR1敲除载体的构建利用在线工具（http://skl.scau.edu.cn/）从OsBEAR1基因序列的特异性区段中选择待敲除的靶序列：“5′-GGCTCTCGTCGACCGTATCA-3′”（SEQIDNO：4）。选用带启动子OsU6a的sgRNA表达载体“pYLsgRNA-OsU6a”，合成靶序列相应的接头引物：上游引物：5′-GCCGGGCTCTCGTCGACCGTATCA-3′下游引物：5′-AAACTGATACGGTCGACGAGAGCC-3′将两引物退火结合形成小DNA片段。用引物UF:5′-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3′和gR-R:5′-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3′以pYLsgRNA-OsU6a载体为模板进行反向PCR，使其线性化。用限制性内切酶BsaI酶切线性化的pYLsgRNA-OsU6a然后加入退火后的带接头的靶序列DNA片段，然后用T4连接酶连接，获得插入靶序列的sgRNA表达载体线性化DNA片段。接着，利用巢试引物Pps:TTCAGAGGTCTCTACCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGGPgs：AGCGTGGGTCTCGCTCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC以插入靶序列的线性化DNA片段为模板进行PCR，电泳回收目的片段并用BsaI酶切备用。选用带Cas9的双元载体“pYLCRISPR/Cas9P35S”，将该载体用BsaI双酶切并与上述BsaI酶切过的目的片段连接，转化大肠杆菌后于Kan培养基上培养，用测序引物SP-R:5′-CGACATAGATGCAATAACTTCG-3′进行测序筛选正确的重组克隆。提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水稻转录因子基因

【技术特征摘要】
1.水稻转录因子基因OsBEAR1在培育胚芽鞘增长和/或适于田间直播的水稻品种中的应用，其特征在于，所述水稻转录因子基因OsBEAR1编码如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的水稻转录因子基因OsBEAR1具有SEQIDNO：2所示编码区的核苷酸序列。


3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，其是下调或敲除水稻中所述水稻转录因子基因OsBEAR1的表达。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述敲除水稻中所述水稻转录因子基因OsBEAR1的表达，其中敲除针对的靶序列为：“5′-GGCTCTCGTCGACCGTATCA-3′”。


5.一种培育胚芽鞘增长和/或适合田间直播的水稻品种的方法，其特征在于，将水稻中的OsBEAR1基因进行敲除，经过筛选获得稳定可遗传的胚芽鞘增长的水稻植株。...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈涛，滕炎桐，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11