植物种子含油量的正调控基因AtMIF1及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及植物种子含油量的正调控基因AtMIF1及其应用。所述基因AtMIF1的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术从拟南芥中分离得到AtMIF1基因，该基因在拟南芥的早期胚胎和胚乳中表达，到心形胚时停止表达。通过过表达载体构建及转基因技术，研究证实AtMIF1对种子中油脂的积累有重要的调控作用，AtMIF1基因的过表达促进种子含油量显著性提高，且AtMIF1的表达调控对植物的营养生长与生殖过程没有影响，可以完好的保持该基因表达调控前原品种的产量与生长发育特性。

The positive regulatory gene atmif1 of oil content in plant seeds and its application

【技术实现步骤摘要】
植物种子含油量的正调控基因AtMIF1及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及植物种子含油量的正调控基因AtMIF1及其应用。
技术介绍
植物油是一种可再生资源，其中86％作为人类主要的油料来源和14％作为生物燃料和油类化学品。到2026年，全球食品植物油需求预计将增加219.8吨，相当于增加16％(经合组织/粮农组织，2017年)。在过去，将更多耕地用于油料作物的种植来满足日益加大的需求。然而，耕地被破坏生态被污染，以目前产量增加的速度无法满足未来的需求。我国有近14亿人口，多数人将植物油作为主要的油脂来源。如何保证中国的油料作物产量安全已成为当前油料作物生产中的热点难点问题。利用现代分子生物学技术，培育高产的品种是解决这一问题的主要途径。油料作物的产量高低直接取决于种子中油脂的积累，研究有关调控种子油含量的调控基因有助于解决油料作物的产量问题。胚胎是油料作物种子的主要组成成分，是油脂形成与储存的主要场所。对胚胎中积累油脂的调控基因的功能研究至关重要。但在油料作物中，促进种子油含量提升的基因却知之甚少。F-box蛋白在动植物中均被广泛研究，F-box蛋白是26S蛋白降解途径中的SKP1-Cullin1-F-box(SCF)复合体中的一员，其蛋白的N端F-box连接入复合体，C端直接和被降解的蛋白相互作用。在拟南芥中F-box蛋白具有近700个成员，AtMIF1在被子植物中是高度保守的，在十字花科的不同物种的MIF1相似度非常高。这将表明AtMIF1基因具有广泛应用的潜力。专利技术内容本专利技术针对现有技术的不足，目的在于提供植物种子含油量的正调控基因AtMIF1及其应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种正调控植物种子含油量基因AtMIF1，其核苷酸序列如下1)或2)所示：1)如SEQIDNO.1所示的CDS序列；2)与1)限定的CDS序列至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％、或至少具有99％同源性的DNA序列。一种正调控植物种子含油量基因AtMIF1编码的蛋白质，氨基酸序列如下1)或2)所示：1)如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；2)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列的蛋白质的N段和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；3)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。上述方案中，2)中所述如SEQIDNO.2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质是指：与SEQIDNO.2所示氨基酸序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％、或至少具有99％同源性，且具有正调控植物种子含油量功能的蛋白质。含有正调控植物种子含油量基因AtMIF1的过表达载体，包括GCD1启动子序列-AtMIF1CDS序列-转录终止序列。上述方案中，所述过表达载体还包括LAT52启动子-RFP序列-转录终止序列。上述方案中，所述过表达载体中AtMIF1CDS序列的C端融合有小肽标签1×FLAG。上述含有正调控植物种子含油量基因AtMIF1的过表达载体构建方法，包括如下步骤：1)以拟南芥基因组为模板，扩增出AtMIF1CDS序列和GCD1启动子序列；2)将GCD1启动子、NOS转录终止序列以及AtMIF1CDS序列分别通过双酶切法连接到pCAMBIA1300载体上，构建得到由GCD1启动子驱动的AtMIF1CDS的pCAMBIA1300过表达载体。上述方案中，所述构建方法还包括：在AtMIF1CDS的C端连接上小肽标签1×FLAG，在NOS转录终止序列后面，将LAT52-RFP-NOS序列通过双酶切法连接到pCAMBIA1300载体上，构建得到含有GCD1启动子驱动的AtMIF1CDS、LAT52启动子驱动的RFP的pCAMBIA1300过表达载体。本专利技术的有益效果：本专利技术从拟南芥中分离得到AtMIF1基因，该基因在拟南芥的早期胚胎和胚乳中表达，到心形胚时停止表达。通过过表达载体构建及转基因技术，研究发现AtMIF1基因参与控制拟南芥种子中油脂的最终积累的具体途径，证实AtMIF1对种子中油脂的积累有重要的调控作用，AtMIF1基因的过表达促进种子含油量显著性提高，且AtMIF1的表达调控对植物的营养生长与生殖过程没有影响，可以完好的保持该基因表达调控前原品种的产量与生长发育特性，因此，可将AtMIF1基因应用于产量改良品系的开发。附图说明图1为AtMIF1基因结构，图1中灰色矩形为非翻译区(UTR)，淡紫色为外显子区，绿色矩形代表F-box功能域，黄色矩形代表FBD功能域。图2为AtMIF1基因的表达模式，图2(a)通过RT-qPCR，分别检测了拟南芥中根，茎，叶，花和果中AtMIF1的表达水平，UBQ10为内参基因多聚泛素酶基因10；图2(b)～图2(h)为AtMIF1启动子驱动β-glucuronidase(GUS)报告基因展示AtMIF1启动子的活性，图2b展示小苗期没有GUS活性，图2c展示合子期种子合子和胚乳有GUS活性，图2d展示二胞时期种子有较强的GUS活性，图2e展示16胞时期种子有较强的GUS活性,图2f展示早期球形胚时期种子有较强的GUS活性，图2g展示晚期球形胚时期种子较前一时期有减弱GUS活性，图2h展示心形胚时期种子没有GUS活性；a中标尺长度为1mm，c-h中标尺长度为20μm。图3为过表达载体构建过程，其中图3A为修饰后的pCAMBIA1300载体，即转基因的双元载体，其中SpeI和AvrII酶切位点是在pCAMBIA1300载体基础上添加的；图3B为拟南芥过表达AtMIF1载体各元件构造简图，GCD1启动子通过SacI和BamHI连入pCAMBIA1300载体，AtMIF1CDS通过KpnI和XbaI连入pCAMBIA1300载体，NOS转录终止序列通过SpeI和AvrII连入pCAMBIA1300载体,LAT52-RFP-NOS通过AvrII和HindIII连入pCAMBIA1300载体。图4为AtMIF1基因过表达的分子生物学鉴定，Col为野生型拟南芥作为对照，OE-5，OE-8分别代表了GCD1驱动的AtMIF1的过表达株系5和8，在5和8号株系中AtMIF1的mRNA水平分别上调了近4000倍和300倍。图5为转化过表达载体后转基因拟南芥在种子分泌的粘多糖和含油量表现型以及种子大小、单株种子的干重、单株苗子的鲜重、单株苗子的高度的测定结果；(a)成熟野生型Col种子表面的粘多糖的钌红染色与AtMIF1过表达转基因株系5和过表达转基因株系8种子表面的粘多糖的钌红染色；(b)测量野生型和过表达株系5和8中种子表面粘多糖的厚度；(c)测量野生型和过表达株系5和8中种子的含油量；(d)测量野生型和过表达株系5和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种正调控植物种子含油量基因

【技术特征摘要】
1.一种正调控植物种子含油量基因AtMIF1，其特征在于，核苷酸序列如下1）或2）所示：
1）如SEQIDNO.1所示的CDS序列；
2）与1）限定的CDS序列至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%、或至少具有99%同源性的DNA序列。


2.权利要求1所述正调控植物种子含油量基因AtMIF1编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如下1）或2）或3）所示：
1）如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；
2）如SEQIDNO.2所示氨基酸序列的蛋白质的N段和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
3）如SEQIDNO.2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。


3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，2）中所述如SEQIDNO.2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质是指：与SEQIDNO.2所示氨基酸序列至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%、或至少具有99%同源性，且具有正调控植物种子含油量功能的蛋白质。


4.含有权利要求1所述正调控植物种子含油量基...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙蒙祥，程天河，赵鹏，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42