人脐带间充质干细胞外泌体的用途制造技术

本发明专利技术公开了人脐带间充质干细胞外泌体的用途。具体为人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途。可通过促进CK19阳性的胰腺导管上皮细胞分化为可分泌胰岛素的胰岛β细胞，使β‑细胞的数量和功能增加，进而对1型糖尿病小鼠产生较好的血糖调控作用。

The use of human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes

【技术实现步骤摘要】
人脐带间充质干细胞外泌体的用途
本专利技术涉及药物治疗领域，尤其涉及人脐带间充质干细胞外泌体的用途。
技术介绍
无论是1型还是2型糖尿病，随着其病理进展都会出现β-细胞结构和功能的进行性破坏，最终引起胰岛素分泌的绝对不足，而引起各种糖尿病并发症，最终危及患者生命。目前糖尿病的治疗主要有以下几种方法：胰岛素及其类似物、胰岛素增敏剂、胰岛素促泌剂以及一些新型降糖药。但由于这些药物的治疗目的在于降糖，只能起到对症治疗的目的，而无法达到对因治疗的目的。因此，随着病程进展，会导致胰腺β-细胞进行性破坏，最终导致其功能丧失。因此，如何保护内源性胰岛β-细胞，使其结构和功能免于破坏，甚至促进内源性胰腺组织胰岛β-细胞功能恢复是目前研究的热点和难点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞外泌体的用途。为实现上述目的，本专利技术提供一种人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途。进一步，所述用途为降低血糖的用途。进一步，所述用途为增加胰岛β-细胞的用途。进一步，所述用途为增加内源性分泌胰岛素的胰岛细胞再生的用途。本专利技术的实施例验证了人脐带间充质干细胞外泌体(hucMSCs-Exo)可通过促进CK19阳性的胰腺导管上皮细胞分化为可分泌胰岛素的胰岛β细胞，使β-细胞的数量和功能增加，进而对1型糖尿病小鼠产生较好的血糖调控作用。附图说明图1是动态光散射法测定外泌体粒径结果图(纵坐标为粒径占比，横坐标为粒径大小)。图2是扫描电镜观察外泌体的大小与形态图(比例尺为100nm)。图3是hucMSCs-Exo的标志性标志物westernblot检测结果图。图4是hucMSCs-Exo体外处理胰腺组织后H&E染色结果图。图5是hucMSCs-Exo治疗小鼠期间小鼠体重的检测结果图。图6是hucMSCs-Exo第一次治疗后小鼠血糖值的对比图。图7是hucMSCs-Exo治疗治疗全部结束小鼠血糖值前后对比图。图8是hucMSCs-Exo治疗小鼠前后小鼠HOMA-B值结果图。图9是hucMSCs-Exo治疗小鼠后胰腺组织H&E染色结果图。图10是hucMSCs-Exo治疗小鼠后胰腺组织胰岛数量统计结果图。图11是hucMSCs-Exo治疗小鼠后小鼠胰腺组织Insulin和CK19免疫荧光染色结果图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：细胞培养及hucMSCs-Exo分离鉴定1、分离：用含有10％胎牛血清的DMEM/F-121:1(指含有10％胎牛血清的DMEM与F-12的体积比为1:1)培养基培养人脐带间充质干细胞(hucMSCs)，该细胞由新生儿脐带分离得到。诱导分化前一天，将hucMSCs细胞接种至10厘米培养板中，使第二天细胞汇合度为50-70％，1xPBS润洗三次，更换为无血清DMEM/F-121:1(指无血清DMEM与F-12的体积比为1:1)培养基，继续培养至48小时收集上清，再次加入无血清培养基，48小时后再次收集培养上清。收集的细胞培养上清按照4℃，3000rpm，15分钟，4℃，10000xg，30分钟，过0.22um滤膜，100000xg离心80分钟，得到沉淀,再用1xPBS润洗一次，100000xg离心80分钟，得到沉淀即为外泌体即为hucMSCs-Exo(人脐带间充质干细胞来源的外泌体)。2、鉴定：1)、粒径分布取100μL外泌体样品用PBS稀释至1mL并混匀，将稀释后的样品加入10mm方形聚苯乙烯样品池(DTS0012)中，应用NanoZS90纳米粒径分析仪，通过动态光散射法测量样品的粒径和多分散系数，结果见图1。其外泌体粒径约为158nm，2)、透射电子显微镜取外泌体适量，用PBS稀释后滴加于铜网上，1％磷钨酸负染，再滴至专用铜网上，待其自然挥干，用透射电子显微镜观察、拍照。结果见图2，图2的A和B均为本专利技术的外泌体。电镜结果同样显示外泌体大小与形态和文献报道相一致。3)、蛋白质免疫印迹法(Westernblotting)检测hucMSCs-Exo特异性蛋白的表达(1)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳a.安装洗净的玻璃板(1.5mm或1.0mm)，在两板之间加满蒸馏水检漏。b.按表1分别配制浓缩胶和分离胶。表1聚丙烯酰胺凝胶配方表试剂名称分离胶(10％)浓缩胶(5％)ddH2O4mL1.7mL30％丙烯酰胺3.3mL0.5mL4×lowerbuffer2.5mL无4×upperbuffer无0.75mL10％过硫酸铵0.1mL0.03mLTEMED0.006mL0.003mLc.在两板间加入新配的10％分离胶约8mL，用2mL无水乙醇压胶。d.待分离胶完全凝固后，倒掉上层的无水乙醇，并用吸水纸吸干。加入新配的5％浓缩胶至玻璃板最顶部，迅速插入梳子，应避免产生气泡。待完全凝固后，垂直拔出梳子。e.安装跑胶装置，内槽加入1×Runningbuffer检漏。确定不漏后在内外槽加入1×Runningbuffer，取3μL蛋白Marker和蛋白样品各50μg依次上样。用80V电压跑胶。约3h后，溴酚蓝跑出分离胶，停止电泳。(2)、免疫印迹a.转膜：于甲醇中浸泡PVDF膜15min，在1×Transferbuffer中将SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白于4℃冰箱中用80V的电压转至PVDF膜上，90min后停止。b.封闭：将膜浸没于封闭液中，室温封闭1h。c.一抗孵育：用5％BSA分别稀释TSG101，CD9，CD63或GAPDH一抗，具体比例参照说明书，于摇床上4℃过夜孵育。d.洗膜：回收一抗，将膜浸没于1×TBST中，于摇床上漂洗3次，每次10min。e.二抗孵育：用封闭液稀释二抗，具体比例参照说明书，于摇床上室温孵育1h。f.洗膜：回收二抗，将膜浸没于1×TBST中，于摇床上漂洗3次，每次10min。g.显影：预冷显影仪，把膜放入显影仪隔板中，将ECL显影液的A液和B液按等体积混合后均匀滴加于膜上，调节明场亮度和清晰度，调至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途。/n

【技术特征摘要】
1.人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途。


2.如权利要求1所述人脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗糖尿病药物的用途，其特征在于，所述用途为降低血糖的用途。


3.如权利要求1所述人脐带间充质...

【专利技术属性】
技术研发人员：李良成，钱丽霞，黄飞榕，
申请(专利权)人：博生众康厦门医药生物技术股份有限公司，厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35