本发明专利技术公开了一种培美曲塞酸中2‑氨基‑4,6‑二羟基嘧啶及4‑氨基‑2,6‑二羟基嘧啶的检测方法。该方法以Acclaim RSLC120 C18为色谱柱，采用LC‑MS检测方法对培美曲塞酸中杂质2‑氨基‑4,6‑二羟基嘧啶及4‑氨基‑2,6‑二羟基嘧啶进行定性和定量，并进行了方法学验证，经实验证明，该方法具有专属性强、快速、灵敏、准确等优点。本发明专利技术首次建立了一种培美曲塞酸中杂质2‑氨基‑4,6‑二羟基嘧啶及4‑氨基‑2,6‑二羟基嘧啶的定性和定量方法，便于对培美曲塞酸的质量进行控制，从而提高了培美曲塞二钠的用药安全性。
Determination of 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidine and 4-amino-2,6-dihydroxypyrimidine in pemetrexed acid
【技术实现步骤摘要】
培美曲塞酸中2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶的检测方法
本专利技术涉及一种培美曲塞酸中2种杂质(2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶)的检测方法，属于医药
技术介绍
培美曲塞酸是培美曲塞二钠的中间体，培美曲塞二钠(PemetrexedDisodium)是礼来公司推出的一种抗癌新药，2004年2月被美国FDA批准与顺铂联用治疗一种罕见的癌症——恶性胸膜间皮瘤，同年10月FDA又以快速审批的方式批准培美曲塞二钠作为局部晚期肺癌或转移性非小细胞肺癌的二线治疗。目前，已在全球60多个国家和地区上市。培美曲塞二钠联合顺铂用于治疗无法手术的恶性胸膜间皮瘤。培美曲塞通过运载叶酸的载体和细胞膜上的叶酸结合蛋白运输系统进入细胞内。一旦培美曲塞进入细胞内，它就在叶酰多谷氨酸合成酶的作用下转化为多谷氨酸的形式。多谷氨酸存留于细胞内成为胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的抑制剂而在正常组织内浓度很低。多谷氨酸化代谢物在肿瘤细胞内的半衰期延长，从而也就延长了药物在肿瘤细胞内的作用时间。2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶是培美曲塞酸生产过程中的副产物，均具警示结构可能存在遗传毒性，因此应制定2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶在培美曲塞酸中的检测方法，对培美曲塞酸的质量进行控制。但经检索，目前尚无关于2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶在培美曲塞酸中的含量检测方法的报道。培美曲塞酸，英文名称：Pemetrexeddisodium，分子式：C20H21N5O6；分子量：427.417，结构式如下所示：2-氨基-4,6-二羟基嘧啶，英文名称：2-amino-4,6-dihydroxypyrimidine，分子式：C4H5N3O2；分子量：127.10，结构式如下所示：4-氨基-2,6-二羟基嘧啶，英文名称：4-amino-2,6-dihydroxypyrimidine，分子式：C4H5N3O2；分子量：127.10，结构式如下所示：
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术首次提供了一种培美曲塞酸中杂质2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶的检测方法。该方法以AcclaimRSLC120C18为色谱柱采用LC-MS检测方法对培美曲塞酸中杂质2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶进行定性、定量，并进行了方法学验证。经实验证明，该方法具有专属性强、快速、灵敏、准确等优点，能够可靠地对培美曲塞酸中杂质2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶进行定性定量分析。本专利技术的技术方案是：一种培美曲塞酸中2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶的检测方法，其特征是，将培美曲塞酸样品溶解(采用乙腈-水(1:1)溶解)后采用LC-MS检测方法对培美曲塞酸中杂质2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶进行定性、定量。其中，色谱条件为：色谱柱：AcclaimRSLC120C18(2.0×100mm，2.2μm)，流速：0.2ml/min，柱温：20～50℃，进样量：2μl，流动相：0.1％乙酸水溶液-乙腈。梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱表优选梯度洗脱条件，如下表3所示。质谱条件为：离子源：电喷雾电离源(ESI)，正离子模式：选择定量(SRM)模式，喷雾电压(IS)：3500V；蒸发温度275℃；鞘气(Gas1)：35Arb；辅助气(Gas2)：7Arb；离子传输管温度(IonTransferTubeTemp)：325℃；用于定量分析的离子对为m/z128.08→m/z60.17(2-氨基-4,6-二羟基嘧啶)及m/z128.12→m/z68.08(4-氨基-2,6-二羟基嘧啶)，质谱条件如表2所示。表2质谱条件表进一步的，本专利技术采用外标法测定培美曲塞酸中2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶。本专利技术的优势是：1、2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶是培美曲塞酸生产过程中的副产物，具有警示结构。本专利技术首次建立了培美曲塞酸中杂质2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶的检测方法，便于对培美曲塞酸的质量进行控制，从而提高了培美曲塞二钠的用药安全性。2、分离效果好、灵敏度高在高效液相色谱法中2-氨基-4,6-二羟基嘧啶在混合溶液中保留时间与对照溶液中稍有差异且受杂峰干扰，通过调节酸度、使用缓冲盐、使用离子对试剂、更换色谱柱均不能改善，鉴于质谱分析法的定量模式可以消除杂峰干扰，所以我们采用灵敏度极高的质谱分析法来控制培美曲塞酸中2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶含量。本专利技术首次建立了LC-MS的检测方法，并进行了方法优化，2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶优化结果见图1～2，方法优化使这两种成分与培美曲塞酸能够得到很好的分离。从图3～6可以看出：2-氨基-4,6-二羟基嘧啶RT为1.48min；4-氨基-2,6-二羟基嘧啶RT为1.53min；培美曲塞酸峰RT为5.43min，2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶与培美曲塞酸分离效果好。3、方法的专属性强、快速、灵敏、准确经实验证明，该方法具有专属性强(专门针对2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶)、快速、灵敏(检测限分别为0.1671ng/ml及0.1865ng/ml，定量限分别为0.3341ng/ml及0.3730ng/ml)、准确(94.29％～104.76％及87.18％～100.00％)等优点，能够可靠地对培美曲塞酸中的2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶含量进行定性定量分析。附图说明图1为2-氨基-4,6-二羟基嘧啶优化子离子和碰撞能图；图2为4-氨基-2,6-二羟基嘧啶优化子离子和碰撞能图；图3为2-氨基-4,6-二羟基嘧啶(RT：1.48min)及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶质谱图(RT：1.53min)；图4为培美曲塞酸样品谱图(RT：5.43min)；图5为2-氨基-4,6-二羟基嘧啶峰提取图；图6为4-氨基-2,6-二羟基嘧啶峰提取图。具体实施方式实施例11仪器与材料1.1仪器：三重四级杆液质联用仪(ThermoUltimate3000-TSQQuantiva)；1.2试剂：乙腈为色谱级，水为超纯水。2方法与结果2.1色谱和质谱条件色谱柱：AcclaimRSLC120C18(2.0×100mm，2.2μm)，流速：0.2ml/min，柱温：20～50℃，进样量：2μl，流动相：0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种培美曲塞酸中2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶的检测方法，其特征是，将培美曲塞酸样品溶解后采用LC-MS检测方法对培美曲塞酸中杂质2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶进行定性、定量；/n其中，色谱条件为：Acclaim RSLC120 C18色谱柱，流动相：0.1％乙酸水溶液-乙腈。/n
【技术特征摘要】
1.一种培美曲塞酸中2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶的检测方法，其特征是，将培美曲塞酸样品溶解后采用LC-MS检测方法对培美曲塞酸中杂质2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶进行定性、定量；
其中，色谱条件为：AcclaimRSLC120C18色谱柱，流动相：0.1％乙酸水溶液-乙腈。
2.如权利要求1所述的一种培美曲塞酸中2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶的检测方法，其特征是，采用流动相梯度洗脱，梯度洗脱条件见下表，
时间/min
0.1％乙酸水溶液/％
乙腈/％
0
75～95
25～5
3
75～95
25～5
4
40～60
60～40
8
40～60
60～40
9
75～95
25～5
20
75～95
25～5
。
3.如权利要求2所述的一种培美曲塞酸中2-氨基-4,6-二羟基嘧啶及4-氨基-2,6-二羟基嘧啶的检测方法，其特征是，梯度洗脱条件见下表，
时间/min
0.1％乙酸水溶液/％
乙腈/％
0
85
15
3
85
15
4
50
50
8
50
50
【专利技术属性】
技术研发人员：闫玲玲，钱振英，董占静，
申请(专利权)人：山东铂源药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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