【技术实现步骤摘要】
一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用
本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用。
技术介绍
利拉鲁肽[Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1(7-37)]为GLP-1(胰高血糖素样肽-1)类似物，在治疗2型糖尿病具有优良的效果。目前，基因工程生产利拉鲁肽主要采用大肠杆菌进行表达，其方法普遍是将Arg34-GLP-1(7-37)片段融合分子伴侣和连接肽进行表达，然后将分子伴侣及连接肽用特异性工具酶切除，得到中间体肽Arg34-GLP-1(7-37)后再对其进行脂肪酸修饰得到利拉鲁肽。如中国专利CN106434717A所公开的通过加入HIS标签亲和层析纯化得到Arg34-GLP-1(7-37)的可溶性融合蛋白，再用肠激酶进行切割获得Arg34-GLP-1(7-37)；又如中国专利CN104592381A所公开的利用大肠杆菌发酵诱导表达获得hI-GLP-1融合蛋白，然后经复性、酶切、分离等操作获得(Arg34-GLP-1(7-37))。两种方法均需要通过多个工序步骤...
【技术保护点】
1.一种利拉鲁肽的纯化方法，其特征在于包括如下步骤：利用中低压反相色谱层析系统对含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液进行初纯和精纯，获得目的蛋白利拉鲁肽；其中，固定相为有机聚合物反相色谱材料，用于洗脱的流动相包含至少一种能与水混溶的有机溶剂和至少一种pH缓冲物质，pH值为6～9。/n
【技术特征摘要】
1.一种利拉鲁肽的纯化方法，其特征在于包括如下步骤：利用中低压反相色谱层析系统对含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液进行初纯和精纯，获得目的蛋白利拉鲁肽；其中，固定相为有机聚合物反相色谱材料，用于洗脱的流动相包含至少一种能与水混溶的有机溶剂和至少一种pH缓冲物质，pH值为6～9。
2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的纯化方法，其特征在于：所述的含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液是大肠杆菌表达得到的利拉鲁肽融合蛋白包涵体，在变性溶液充分溶解变性，并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物后直接修饰酶切得到。
3.根据权利要求2所述的利拉鲁肽的纯化方法，其特征在于：所述的含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)将具有利拉鲁肽融合基因的大肠杆菌工程菌株进行发酵，诱导，提取含有利拉鲁肽融合蛋白的包涵体；其中，利拉鲁肽融合基因具有形如A-B-C结构的基因序列，其中A为分子伴侣蛋白编码基因，B为连接肽编码基因，C为Arg34-GLP-1(7-37)片段编码基因；
(2)将步骤(1)中获得的含有利拉鲁肽融合蛋白的包涵体在变性溶液充分溶解变性，并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物，得到反应体系，反应，使融合蛋白与脂肪酸活化物酰化连接；
(3)待步骤(2)反应完成后加入工具酶，得到酶切体系；酶切，得到含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液。
4.根据权利要求3所述的利拉鲁肽的纯化方法，其特征在于：
所述的利拉鲁肽融合蛋白是从N端到C端，分子伴侣蛋白、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)片段依次连接得到的蛋白；
所述的分子伴侣蛋白为KSI、PagP或TrxA蛋白；
所述的连接肽优选为如X1…XnK所示的肽序列，X为D或者E，n表示氨基酸X的数目，为2至4的整数；
所述的分子伴侣蛋白、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)各片段之间通过酰胺键相连；
步骤(2)中所述的变性溶液为尿素、盐酸胍和SDS中的至少一种；
所述的变性溶液的浓度为4～8M；
步骤(2)中所述的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或至少两种；
所述的有机溶剂的用量按其在反应体系中的浓度为体积百分比为5～50％计算；
步骤(2)中所述的缚酸剂选自三乙胺，N,N-二异丙基乙胺和吡啶中的至少一种；
所述的缚酸剂的加入量应能够使反应体系的pH值达到8.0～12...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹永恒，陈亮航，黄亮，武振军，曹春来，周翠，夏志成，谢鑫，邓慧兴，
申请(专利权)人：珠海联邦制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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