一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用。本发明专利技术利用中低压反相色谱层析系统对含有利拉鲁肽的混合物进行分离，获得利拉鲁肽；其中，固定相为有机聚合物反相色谱材料，用于洗脱的流动相包含至少一种能与水混溶的有机溶剂和至少一种pH缓冲物质，pH值为6～9。本发明专利技术采用中低压反相色谱层析即可获得高纯度的利拉鲁肽，并且其采用更加方便及价格更加低廉的有机聚合物反相填料，相对于其他纯化手段有着很大的成本优势，适合于工业制备利拉鲁肽。

A purification method of lilalutide and its application

【技术实现步骤摘要】
一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用
本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种利拉鲁肽的纯化方法及其应用。
技术介绍
利拉鲁肽[Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1(7-37)]为GLP-1(胰高血糖素样肽-1)类似物，在治疗2型糖尿病具有优良的效果。目前，基因工程生产利拉鲁肽主要采用大肠杆菌进行表达，其方法普遍是将Arg34-GLP-1(7-37)片段融合分子伴侣和连接肽进行表达，然后将分子伴侣及连接肽用特异性工具酶切除，得到中间体肽Arg34-GLP-1(7-37)后再对其进行脂肪酸修饰得到利拉鲁肽。如中国专利CN106434717A所公开的通过加入HIS标签亲和层析纯化得到Arg34-GLP-1(7-37)的可溶性融合蛋白，再用肠激酶进行切割获得Arg34-GLP-1(7-37)；又如中国专利CN104592381A所公开的利用大肠杆菌发酵诱导表达获得hI-GLP-1融合蛋白，然后经复性、酶切、分离等操作获得(Arg34-GLP-1(7-37))。两种方法均需要通过多个工序步骤(如复性、融合蛋白纯化等)获得中间体肽(Arg34-GLP-1(7-37))后再进行脂肪酸修饰而得到利拉鲁肽，其工艺步骤繁琐，需要经过多步工序，容易造成目标蛋白的丢失而产量降低，增加下游的经济成本。本专利技术申请人在前期的研究中，直接利用大肠杆菌表达含有分子伴侣、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)片段的融合蛋白包涵体直接修饰酶切转化为利拉鲁肽的制备方法(一步法)，具体可见中国专利技术专利申请CN107881187A，其公开了在Arg34-GLP-1(7-37)片段融合分子伴侣和连接肽的包涵体变性液中加入有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物直接修饰、酶切直接获得利拉鲁肽的制备方法。该方法大大缩短了利拉鲁肽的制备过程，解决了前面所述方法的工艺繁琐，制备成本高的问题。但由于包涵体中通常会附带大量的细胞碎片、宿主细胞蛋白、核酸以及多糖等大分子杂质，并且制备过程中加入了高浓度的变性剂、有机溶剂及有机碱等物质，其中物质混杂，料液粘度大，这样势必会给下游的分离纯化较大的压力，目标蛋白利拉鲁肽的纯化是该方法大规模工业化生产的关键所在。因此，开发一种适用于一步法制备利拉鲁肽的纯化方法显得尤其重要。包涵体蛋白的纯化普遍性地倾向于采用条件较为温和的方法，常用的方法有凝胶过滤、离子交换色谱以及疏水层析色谱等。凝胶过滤(排阻色谱)是根据蛋白分子大小或结构不同进行分离的色谱技术，其对待分离纯化的样品一般要求无沉淀、黏度小等，在进行柱层析之前，样品需进行繁琐的预处理，工业化生产较难实现。离子交换色谱是通过不同蛋白之间的电荷差异进行分离，其特征是“低盐浓度上样，高盐浓度洗脱”，利拉鲁肽的一步法制备过程中含有高浓度的变性剂、有机溶剂等，若采用离子交换层析需要将料液大体积稀释或者更换溶剂体系，并不利于工业化生产。疏水层析色谱是根据蛋白分子的疏水性质差异进行分离的层析技术，通常主要用于疏水性质较弱的蛋白分子之间的分离纯化，由于利拉鲁肽是经过长链脂肪酸修饰后的GLP-1类似物，由于长脂肪酸链的作用，其疏水性质远远强于常规的蛋白分子，在疏水层析介质中的吸附能力极强，导致蛋白质无法从层析介质中洗脱，因此疏水层析并不适用于利拉鲁肽混合物纯化。反相层析在所有层析技术中具有最高的分辨率，因此在层析
中被广泛应用。但其用于包涵体蛋白纯化时，通常需要在之前加用其它色谱层析技术进行初纯。中国专利CN104592381A公开了一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法，其是一种采用融合蛋白包涵体制备利拉鲁肽中间体肽的方法，披露了采用Q-FF阴离子交换进行粗纯化，然后再用C8反相填料进行纯化获得利拉鲁肽中间体肽的方法，该方法采用离子交换层析进行纯化，包涵体变性溶解后必须加入大量的复性缓冲液进行复性处理，上样体积大，不便于工业化生产；C8为反相硅胶填料，相对一般的层析色谱材料价格昂贵，成本高。因此，利用反相层析技术在更低的成本下纯化利拉鲁肽，仍是有待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利拉鲁肽的纯化方法。本专利技术的另一目的在于提供上述利拉鲁肽的纯化方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种利拉鲁肽的纯化方法，包括如下步骤：利用中低压反相色谱层析系统对含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液进行初纯和精纯，获得目的蛋白利拉鲁肽；其中，固定相为有机聚合物反相色谱材料，用于洗脱的流动相包含至少一种能与水混溶的有机溶剂和至少一种pH缓冲物质，pH值为6～9；所述的含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液为利拉鲁肽融合蛋白包涵体经溶解变性，修饰酶切后的溶液；具体是大肠杆菌表达得到的利拉鲁肽融合蛋白包涵体，在变性溶液充分溶解变性，并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物后直接修饰酶切得到；优选为依据公开号为CN107881187A、专利技术名称为“将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用”的国家专利技术专利申请制备得到，具体是通过包括如下步骤的方法制备得到：(1)将具有利拉鲁肽融合基因的大肠杆菌工程菌株进行发酵，诱导，提取含有利拉鲁肽融合蛋白的包涵体；其中，利拉鲁肽融合基因具有形如A-B-C结构的基因序列，其中A为分子伴侣蛋白编码基因，B为连接肽编码基因，C为Arg34-GLP-1(7-37)片段编码基因；(2)将步骤(1)中获得的含有利拉鲁肽融合蛋白的包涵体在变性溶液充分溶解变性，并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物，得到反应体系，反应，使融合蛋白与脂肪酸活化物酰化连接；(3)待步骤(2)反应完成后加入工具酶，得到酶切体系；酶切，得到含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液。所述的利拉鲁肽融合蛋白是从N端到C端，分子伴侣蛋白、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)片段依次连接得到的蛋白；优选为依据公开号为CN107881187A、专利技术名称为“将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用”的国家专利技术专利申请设计得到。所述的分子伴侣蛋白优选为KSI、PagP或TrxA蛋白。所述的连接肽优选为如X1…XnK所示的肽序列，X为D或者E，n表示氨基酸X的数目，为2至4的整数，优选为3～4；更优选为EEEEK、EDK或DDDDK。所述的分子伴侣蛋白、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)各片段之间通过酰胺键相连。步骤(1)中所述的提取是粗蛋白提取，可通过常规的提取步骤进行提取：当融合蛋白为包涵体表达形式时，例如PagP-EEEEK-Arg34GLP-1(7-37)融合蛋白或KSI-DDDDK-Arg34GLP-1(7-37)融合蛋白，包涵体提取优选包含如下步骤：将具有融合基因的大肠杆菌工程菌株发酵液进行固液分离，将获得的菌体用碱性缓冲液重悬，破碎菌体，再用洗涤液洗涤；接着离心得到包涵体。所述的固液分离的方式优选为离心。所述的碱性缓冲液优选为50mM、pH8.5的Tris-HCl缓冲液。所述的洗涤液为50mMTris本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利拉鲁肽的纯化方法，其特征在于包括如下步骤：利用中低压反相色谱层析系统对含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液进行初纯和精纯，获得目的蛋白利拉鲁肽；其中，固定相为有机聚合物反相色谱材料，用于洗脱的流动相包含至少一种能与水混溶的有机溶剂和至少一种pH缓冲物质，pH值为6～9。/n

【技术特征摘要】
1.一种利拉鲁肽的纯化方法，其特征在于包括如下步骤：利用中低压反相色谱层析系统对含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液进行初纯和精纯，获得目的蛋白利拉鲁肽；其中，固定相为有机聚合物反相色谱材料，用于洗脱的流动相包含至少一种能与水混溶的有机溶剂和至少一种pH缓冲物质，pH值为6～9。


2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的纯化方法，其特征在于：所述的含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液是大肠杆菌表达得到的利拉鲁肽融合蛋白包涵体，在变性溶液充分溶解变性，并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物后直接修饰酶切得到。


3.根据权利要求2所述的利拉鲁肽的纯化方法，其特征在于：所述的含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)将具有利拉鲁肽融合基因的大肠杆菌工程菌株进行发酵，诱导，提取含有利拉鲁肽融合蛋白的包涵体；其中，利拉鲁肽融合基因具有形如A-B-C结构的基因序列，其中A为分子伴侣蛋白编码基因，B为连接肽编码基因，C为Arg34-GLP-1(7-37)片段编码基因；
(2)将步骤(1)中获得的含有利拉鲁肽融合蛋白的包涵体在变性溶液充分溶解变性，并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物，得到反应体系，反应，使融合蛋白与脂肪酸活化物酰化连接；
(3)待步骤(2)反应完成后加入工具酶，得到酶切体系；酶切，得到含利拉鲁肽包涵体蛋白的料液。


4.根据权利要求3所述的利拉鲁肽的纯化方法，其特征在于：
所述的利拉鲁肽融合蛋白是从N端到C端，分子伴侣蛋白、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)片段依次连接得到的蛋白；
所述的分子伴侣蛋白为KSI、PagP或TrxA蛋白；
所述的连接肽优选为如X1…XnK所示的肽序列，X为D或者E，n表示氨基酸X的数目，为2至4的整数；
所述的分子伴侣蛋白、连接肽及Arg34-GLP-1(7-37)各片段之间通过酰胺键相连；
步骤(2)中所述的变性溶液为尿素、盐酸胍和SDS中的至少一种；
所述的变性溶液的浓度为4～8M；
步骤(2)中所述的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或至少两种；
所述的有机溶剂的用量按其在反应体系中的浓度为体积百分比为5～50％计算；
步骤(2)中所述的缚酸剂选自三乙胺，N,N-二异丙基乙胺和吡啶中的至少一种；
所述的缚酸剂的加入量应能够使反应体系的pH值达到8.0～12...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永恒，陈亮航，黄亮，武振军，曹春来，周翠，夏志成，谢鑫，邓慧兴，
申请(专利权)人：珠海联邦制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44