用于O型口蹄疫病毒抗体定量检测的上转换发光免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于O型口蹄疫病毒抗体定量检测的上转换发光免疫层析试纸条及其制备方法。本发明专利技术利用大肠杆菌原核表达技术表达O型口蹄疫(O‑FMDV)衣壳蛋白，在体外组装成O型口蹄疫病毒样颗粒作为俘获抗原；利用上转换发光纳米材料特殊的发光性能，将其作为荧光标记物与蛋白G进行偶联，进而与抗体结合，制备得到的本发明专利技术上转换发光免疫层析试纸条。本发明专利技术制备的免疫层析试纸敏感性高、特异性和可重复性好，结果稳定，可应用于O型口蹄疫的抗体水平的监测，有助于进一步了解偶蹄类家畜O型口蹄疫抗体的状况。

Upconversion immunochromatographic strip for quantitative detection of FMDV antibody and its preparation

【技术实现步骤摘要】
用于O型口蹄疫病毒抗体定量检测的上转换发光免疫层析试纸条及其制备方法
本专利技术涉及一种基于上转换发光纳米材料制成的上转换发光免疫层析试纸条及其制备方法，还涉及该上转换发光免疫层析试纸条在O型口蹄疫病毒抗体定量检测中的应用。本专利技术属于材料化学及免疫学检测领域。
技术介绍
口蹄疫病毒的抗原主要有完整病毒和其结构蛋白。由于完整病毒存在灭活不彻底的现象，在使用过程中存在感染的风险；而部分的结构蛋白(如VP1)虽然具有免疫原性，但是与完整病毒在结构上有一定的差异，免疫反应的效果难以保证。病毒样颗粒(VLPs)是不含RNA的空衣壳，与完整病毒具有相同的结构，具有很好的型特异性和免疫原性，但没有感染性，因此是一种最佳的抗原。目前已经有多种病毒样颗粒的疫苗，如：乙肝病毒VLPs疫苗，人乳头瘤病毒VLPs疫苗和戊肝病毒VLPs疫苗投入使用。因此，发展口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其诊断试剂具有很好的应用前景。胶体金免疫层析技术是通过胶体金标记的蛋白沉积在检测线上，通过肉眼观察沉积线的深浅进行定性或半定量分析。由于肉眼观察的局限性，胶体金免疫层析试纸条检测的灵敏性较差，并且不能进行定量分析。目前，已经有量子点、稀土材料、四氧化三铁等发光材料或磁性材料免疫层析定量分析方法的报道。上转换发光纳米材料(UCP)是一种由稀土元素掺杂于晶体的晶格中构成的特殊材料，其在近红外光激发下，可以将所吸收的低能近红外光子通过多光子吸收或者能量传递转化为高能量可见光。上转换发光材料与普通发光有不同的发光过程，在980nm的近红外激发后，产生荧光，具有低能量激发，高能量发射的特点。由于在980nm激发下，其它的生物材料及荧光材料都不会产生荧光发射，而只有上转换发光材料在520-580nm产生荧光发射，因此，检测荧光信号几乎不会有背景干扰。上转换发光的荧光寿命比较长，荧光不易淬灭，而且具有生物相容性好、组织穿透能力强和毒性低等特点，因此，在生物领域的应用具有很大的潜力。目前，口蹄疫诊断的最普遍方法ELISA，其灵敏度比较高，但是耗时比较长，通常需要1h以上才能收集数据。胶体金免疫层析方法已经应用于不同的领域，但是其只能进行定性或半定量检测，因此，具有很大的局限性。将上转换发光材料代替胶体金作为标记物，利用其优良的发光性能，可以实现对口蹄疫病毒的定量检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种基于上转换发光纳米材料制成的上转换发光免疫层析试纸条的制备方法；本专利技术的目的之二在于建立一种使用上述上转换发光免疫层析试纸条定量检测O型口蹄疫病毒抗体的方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种上转换发光免疫层析试纸条，包括依次相连的样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫以及位于下方作为组装平台的PVC底板；其中，所述的样品垫用于添加样品；所述的结合垫上包被有偶联了蛋白G(链球菌蛋白G，简称为蛋白G)的上转换发光纳米材料；所述的分析膜上分别包被有O型口蹄疫病毒病毒样颗粒和兔IgG喷涂的检测线和对照线。其中，优选的，所述的上转换发光纳米材料为柠檬酸修饰的NaYF4:18％Yb,2％Er纳米晶。其中，优选的，所述的柠檬酸修饰的上转换发光纳米材料通过以下步骤制备得到：1)上转换发光纳米材料的合成a称取YCl3·6H2O0.2366g,YbCl3·6H2O0.0775g以及ErCl3·6H2O0.0076g加至100mL圆底烧瓶中，与6mL油酸(OA)、15mL十八烯(ODE)混合；在氮气保护下加热至160℃形成均一的溶液后冷却至室温；缓慢滴加10mLmL含0.1gNaOH和0.148gNH4F的甲醇溶液；反应液缓慢加热至50℃保持40min，再加热至100℃保持40min，除去甲醇和水；接着，在氮气保护下，加热至320℃保持1.5h，溶液自然冷却后，加乙醇沉淀，并用乙醇洗三次，将沉淀分散于6mL环己烷中，得到含有纳米晶的环己烷分散液，待用；b在100mL圆底烧瓶中，加NaCOOCF30.135g和Yb(COOCF3)30.512g，15mL油酸(OA)以及15mL十八烯(ODE)，滴加步骤a获得的含有纳米晶的环己烷分散液，反应液在抽真空下加热至120℃保持40min；接着，在氮气保护下，再加热至320℃保持1.5h，溶液自然冷却后，加乙醇沉淀，并用乙醇洗三次，所的沉淀即为上转换发光纳米材料，将沉淀分散于mL环己烷中，得到上转换发光纳米材料(UCNP)的环己烷分散液，待用；2)上转换发光纳米材料的表面修饰在圆底烧瓶中加0.2gNOBF4，5mLDMF，加入步骤1)合成的20mg上转换发光材料(UCNP)的环己烷分散液，室温搅拌2h。用异丙醇和环己烷进行沉淀，洗三次，沉淀重新分散于DMF中，滴加1.5mL50mg/mL的柠檬酸溶液；室温搅拌过夜后，离心分离，即得到柠檬酸修饰的上转换发光纳米材料(UCNP-COOH)。其中，优选的，所述的样品垫、结合垫由玻璃纤维制成，所述的分析膜由硝酸纤维素膜制成，所述的吸水垫由高密度纤维素材料制成。其中，优选的，所述的上转换发光免疫层析试纸条装配在塑料外壳中，外壳上对应样品垫位置设置加样孔，对应分析膜位置，设置可视窗用于对检测线和对照线进行检测。其中，优选的，所述的O型口蹄疫病毒VLPs由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1以及VP3结构蛋白组装而成。进一步的，本专利技术还提出了一种制备所述的上转换发光免疫层析试纸条的方法，包括以下步骤1)上转换发光纳米材料与蛋白G偶联在EP管中，加200μL浓度为10mg/mL上转换发光纳米材料，加100μL新配的浓度为20mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺NHS和50μL新配的浓度为20mg/mL碳二亚胺EDC，加水至1mL，于室温旋转反应1小时；离心分离后，沉淀物分散于水中，加160μg蛋白G，室温旋转反应4小时；离心分离，沉淀物重新分散后，加牛血清白蛋白BSA封闭过夜；离心分离后，重新分散于保存液中，即得偶联了蛋白G的上转换发光纳米材料，冷藏保存备用；所述的保存液为含0.5％BSA(w/w)，0.5％Tween20(v/v)的Tris-HCl缓冲液；2)划膜：将纯化的O型口蹄疫病毒VLPs稀释至0.4mg/mL，兔IgG稀释至1mg/mL，用专用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜上划膜，VLPs作为检测线，兔IgG作为对照线，划膜量为0.5μL/cm，于室温放置晾干，得到分析膜备用；3)标记结合垫：将偶联了蛋白G的上转换发光纳米材料稀释至2mg/mL，在结合垫上加5μL偶联了蛋白G的上转换发光纳米材料，室温下晾干；4)试纸条组装：将样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫依次粘贴在带粘合剂的PVC底板上，相互交叠1-2mm，组装成大卡片，然后用切条机切割成3mm宽的试纸条；5)装壳：将试纸条装入塑料壳中，塑料外壳上对应样品垫位置设置加样孔，对应分析膜位置，设置可视窗用于对检测线和对照线进行检测。更进一步的，本专利技术还提出了所述的上转换发光免本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种上转换发光免疫层析试纸条，其特征在于，所述的上转换发光免疫层析试纸条包括依次相连的样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫以及位于下方作为组装平台的PVC底板；/n其中，所述的样品垫用于添加样品；所述的结合垫上包被有偶联了蛋白G的上转换发光纳米材料；所述的分析膜上分别包被有O型口蹄疫病毒病毒样颗粒和兔IgG喷涂的检测线和对照线。/n

【技术特征摘要】
1.一种上转换发光免疫层析试纸条，其特征在于，所述的上转换发光免疫层析试纸条包括依次相连的样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫以及位于下方作为组装平台的PVC底板；
其中，所述的样品垫用于添加样品；所述的结合垫上包被有偶联了蛋白G的上转换发光纳米材料；所述的分析膜上分别包被有O型口蹄疫病毒病毒样颗粒和兔IgG喷涂的检测线和对照线。


2.如权利要求1所述的上转换发光免疫层析试纸条，其特征在于，所述的上转换发光纳米材料为柠檬酸修饰的NaYF4:18％Yb,2％Er纳米晶。


3.如权利要求2所述的上转换发光免疫层析试纸条，其特征在于，所述的柠檬酸修饰的上转换发光纳米材料通过以下步骤制备得到：
1)上转换发光纳米材料的合成
a称取YCl3·6H2O0.2366g,YbCl3·6H2O0.0775g以及ErCl3·6H2O0.0076g加至100mL圆底烧瓶中，与6mL油酸(OA)、15mL十八烯(ODE)混合；在氮气保护下加热至160℃形成均一的溶液后冷却至室温；缓慢滴加10mL含0.1gNaOH和0.148gNH4F的甲醇溶液；反应液缓慢加热至50℃保持40min，再加热至100℃保持40min，除去甲醇和水；接着，在氮气保护下，加热至320℃保持1.5h，溶液自然冷却后，加乙醇沉淀，并用乙醇洗三次，将沉淀分散于6mL环己烷中，得到含有纳米晶的环己烷分散液，待用；
b在100mL圆底烧瓶中，加NaCOOCF30.135g和Yb(COOCF3)30.512g，15mL油酸(OA)以及15mL十八烯(ODE)，滴加步骤a获得的含有纳米晶的环己烷分散液，反应液在抽真空下加热至120℃保持40min；接着，在氮气保护下，再加热至320℃保持1.5h，溶液自然冷却后，加乙醇沉淀，并用乙醇洗三次，所的沉淀即为上转换发光纳米材料，将沉淀分散于6mL环己烷中，得到上转换发光纳米材料的环己烷分散液，待用；
2)上转换发光纳米材料的表面修饰
在圆底烧瓶中加0.2gNOBF4，5mLDMF，加入步骤1)合成的20mg上转换发光材料的环己烷分散液，室温搅拌2h；用异丙醇和环己烷沉淀，洗三次，沉淀重新分散于DMF中，滴加1.5mL50mg/mL的柠檬酸溶液，室温搅拌过夜后，离心分离，即得到柠檬酸修饰的上转换发光纳米材料。


4.如权利要求1所述的上...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧琛，孙世琪，侯风萍，张韵，白满元，柳海云，高震东，殷宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62