一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒及其制备方法和应用。所述的试剂盒中含有反应试剂R1、反应试剂R2以及校准品和质控品；其中，所述的反应试剂R1中含有：缓冲剂50‑150mmol/L，电解质100‑200mmol/L，促凝剂0.5‑2％w/w，稳定剂0.05‑0.5％w/w，表面活性剂0.05‑0.2％w/w，防腐剂0.05‑0.5％w/w，pH 7.0‑8.5；其中，所述的反应试剂R2中含有结合有鼠抗人肝细胞生长因子抗体的重组蛋白A蛋白G融合蛋白包被的聚苯乙烯微球。本发明专利技术建立了一套采用准匀相测定技术为基础的试剂盒及其制备方法，该试剂盒可以在全自动生化仪上使用，只需10分钟即可出结果。相较于现有方法操作简便，快捷，能够满足临床上对于简单易行的要求。

A immunoturbidimetric test kit for HGF latex and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种胶乳免疫比浊检测试剂盒及其制备方法和应用，特别涉及一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒及其制备方法和应用。本专利技术属于医药

技术介绍
肝细胞生长因子(Hepatocytegrowthfactor，HGF)是一种多肽生长因子，具有促进包括肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、造血细胞等多种类型细胞的生长、迁移和形态发生的作用。它还参与多种细胞的增殖、迁移，对各类肿瘤的侵袭转移有着重要的诱导作用。早在1992年MTakemura就报道了采用酶联免疫的方法测定血清中肝细胞生长因子浓度的方法。ShiotaG等在1995年报告了采用免疫放射法测定血清中肝细胞生长因子浓度的方法。2005UtoH等报道了一种快速半定量的免疫层析法(rapidsemi-quantitativeimmunochromatographic(IC))来测定肝细胞生长因子浓度的方法。2002年刘友华等申请了肝细胞生长因子的测定方法(申请号02112853.7)，该方法主要应用酶联免疫技术测定肝细胞生长因子。2015年天津医科大学张宁等申请了肝癌标志物单链抗体的制备及其应用的专利(申请号：201510759337.5)，在其专利中也采用了酶联免疫技术在制备试剂盒。酶联免疫检测法的原理是：将肝细胞生长因子(HGF)抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的肝细胞生长因子(HGF)与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的肝细胞生长因子(HGF)抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肝细胞生长因子(HGF)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，计算样品浓度。试剂盒组分通常包括：1)酶标板；2)酶标试剂；3)标准品；4)校准品稀释液；5)样品稀释液；6)显色剂(1个或2个)；7)终止液；8)洗涤液或洗涤液浓缩液。操作步骤包括：加样加酶标抗体、孵育、洗涤、加入显色剂、孵育、加终止液、酶标仪测定。计算测定结果。酶联免疫检测法基于的是一种非匀相检测技术，是一种将抗体固定在固相支持物上的方法。其缺点在于：试剂盒组分多，实验步骤多，需要经过加样、孵育、清洗、再孵育、再清洗、显色等多个步骤，操作复杂，不能实现自动化检测，容易出现操作误差。此外，检测时间长，适用于批量样本的检测，适合科研使用，不能满足临床要求的简单易行的要求。胶乳免疫比浊法由于具有检测方法简单方便，线性范围宽，稳定性好，同时可在全自动生化仪上实现大量样品检测等优点，已经越来越多的被应用于临床检测项目。胶乳免疫比浊法是通过采用物理吸附或共价键合的方式将抗体或抗原偶联到纳米微球的表面，形成微球-抗体(抗原)复合物。此复合物与样品中的抗原(抗体)，通过抗体抗原反应，形成微球-抗体-抗原聚集颗粒，随着免疫反应的不断发生，聚集的颗粒不断增大，从而导致溶液在一定波长的吸光值发生显著的变化，通过测定免疫反应前后吸光度值的变化可以计算出样品中抗原(抗体)的浓度，从而达到检测和诊断疾病的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒及其制备方法和应用。该试剂盒可在全自动生化仪上使用，可实现全自动检测，且只需10分钟即可出结果，线性范围宽，灵敏度高。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒，所述的试剂盒中含有反应试剂R1、反应试剂R2以及校准品和质控品；其中，所述的反应试剂R1中含有：缓冲剂50-150mmol/L，电解质100-200mmol/L，促凝剂0.5-2％w/w，稳定剂0.05-0.5％w/w，表面活性剂0.05-0.2％w/w，防腐剂0.05-0.5％w/w，pH7.0-8.5；其中，所述的反应试剂R2中含有结合有鼠抗人肝细胞生长因子抗体的重组蛋白A蛋白G融合蛋白包被的聚苯乙烯微球。其中，优选的，所述的缓冲剂选自Tricine(N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗非啉)乙磺酸)、PIPES(哌嗪-N，N'-二(2-乙磺酸))、Bis-TrisPropane(双[三(羟甲基)氨基丙烷]/1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)、BES(N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙璜酸)、MOPS(3-(N-吗啡啉)乙磺酸)、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)、TES(N-3-(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、DIPSO(3-[N-N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)、TAPSO(N-3-(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙烷磺酸)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、HEPPSO(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸)、POPSO(哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸)、EPPS(4-羟乙基哌嗪丙磺酸)、TEA(三乙醇胺)、Tricine(N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸)、磷酸盐中的至少一种；其中，优选的，所述的电解质选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠中的至少一种；其中，优选的，所述的促凝剂选自PEG6000，PEG8000，聚凝胺中的至少一种；其中，优选的，所述的稳定剂选自牛血清白蛋白(BSA)、兔血清、牛血清、甘露醇、海藻糖中的至少一种；其中，优选的，所述的表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲通100、聚氧乙基月桂醚中的至少一种；其中，优选的，所述的防腐剂选自叠氮钠、2-氯乙酰胺、脱氢乙酸钠、尼泊尔金甲酯钠、对羟基甘氨酸钠、4-羟基苯甲酸乙酯、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷(BND)、2-羟基吡啶-N-氧化物(Oxy-PYRION)、咪唑烷基脲、甲基异噻唑啉酮(MIT)中的至少一种。其中，优选的，所述的重组蛋白A蛋白G融合蛋白为以基因工程方法获得的蛋白A和蛋白G的融合蛋白，包含金黄色葡萄球菌蛋白A的5个Fc结合域和链球菌蛋白G的2个Fc结合域；所述的聚苯乙烯微球的直径为50nm-300nm，所述重组蛋白A蛋白G融合蛋白与所述聚苯乙烯微球的质量比为100mg～600mg：1g。其中，优选的，所述的重组蛋白A蛋白G融合蛋白包被的聚苯乙烯微球通过以下方法制备得到：将1ml10％的中等密度羧基微球用pH5.0的100mmol/LMES缓冲液清洗两次后，用10ml上述缓冲液重悬并加入20mgEDC，缓慢搅拌15-20分钟；用pH8.2的100mmol/L硼砂缓冲液离心清洗2次后，用pH8.2的100mmol/L硼砂缓冲液重悬微球并温和搅拌；在悬浮液中加入5ml含有5-7mg/ml重组蛋白A蛋白G融合蛋白的20mmol/LpH7.4磷酸缓冲液中，在18-30℃条件下缓慢搅拌2-4小时；用硼砂缓冲液清洗一次后，加入pH8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有反应试剂R1、反应试剂R2、校准品和质控品；/n其中，所述的反应试剂R1中含有：缓冲剂50-150mmol/L，电解质100-200mmol/L，促凝剂0.5-2％w/w，稳定剂0.05-0.5％w/w，表面活性剂0.05-0.2％w/w，防腐剂0.05-0.5％w/w，pH7.0-8.5；/n其中，所述的反应试剂R2中含有结合有鼠抗人肝细胞生长因子抗体的重组蛋白A蛋白G融合蛋白包被的聚苯乙烯微球。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有反应试剂R1、反应试剂R2、校准品和质控品；
其中，所述的反应试剂R1中含有：缓冲剂50-150mmol/L，电解质100-200mmol/L，促凝剂0.5-2％w/w，稳定剂0.05-0.5％w/w，表面活性剂0.05-0.2％w/w，防腐剂0.05-0.5％w/w，pH7.0-8.5；
其中，所述的反应试剂R2中含有结合有鼠抗人肝细胞生长因子抗体的重组蛋白A蛋白G融合蛋白包被的聚苯乙烯微球。


2.如权利要求1所述的肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的缓冲剂选自Tricine(N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗非啉)乙磺酸)、PIPES(哌嗪-N，N'-二(2-乙磺酸))、Bis-TrisPropane(双[三(羟甲基)氨基丙烷]/1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)、BES(N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙璜酸)、MOPS(3-(N-吗啡啉)乙磺酸)、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)、TES(N-3-(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、DIPSO(3-[N-N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸)、TAPSO(N-3-(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙烷磺酸)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、HEPPSO(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸)、POPSO(哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸)、EPPS(4-羟乙基哌嗪丙磺酸)、TEA(三乙醇胺)、Tricine(N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸)、磷酸盐中的至少一种；
所述的电解质选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠中的至少一种；
所述的促凝剂选自PEG6000，PEG8000，聚凝胺中的至少一种；
所述的稳定剂选自牛血清白蛋白(BSA)、兔血清、牛血清、甘露醇、海藻糖中的至少一种；
所述的表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲通100、聚氧乙基月桂醚中的至少一种；
所述的防腐剂选自叠氮钠、2-氯乙酰胺、脱氢乙酸钠、尼泊尔金甲酯钠、对羟基甘氨酸钠、4-羟基苯甲酸乙酯、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷(BND)、2-羟基吡啶-N-氧化物(Oxy-PYRION)、咪唑烷基脲、甲基异噻唑啉酮(MIT)中的至少一种。


3.如权利要求1所述的肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的重组蛋白A蛋白G融合蛋白为以基因工程方法获得的蛋白A和蛋白G的融合蛋白，包含金黄色葡萄球菌蛋白A的5个Fc结合域和链球菌蛋白G的2个Fc结合域；所述的聚苯乙烯微球的直径为50nm-300nm，所述重组蛋白A蛋白G融合蛋白与所述聚苯乙烯微球的质量比为100mg～600mg：1g。


4.如权利要求1所述的肝细胞生长因子胶乳免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的重组蛋白A蛋白G融合蛋白包被的聚苯乙烯微球通过以下方法制备得到：将1ml10％的中等密度羧基微球用pH5.0的100mmol/LMES缓冲液清洗两次后，用10ml上述缓冲液重悬并加入20mgEDC，缓慢搅拌15-20分钟；用pH8.2的100mmol/L硼砂缓冲液离心清洗2次后，用pH8.2的100mmol/L硼砂缓冲液重悬微球并温和搅拌；在悬浮液中加入5ml含有5-7mg/ml重组蛋白A蛋白G融合蛋白的20mmol/LpH7.4磷酸缓冲液中，在18-30℃条件下缓慢搅拌2-4小时；用硼砂缓冲液清洗一次后，加入pH8.2的含1g/LBSA的10ml100mmol/L的甘氨酸缓冲液重悬，缓慢搅拌放置10分钟；用该缓冲液清洗两次，重悬在含0.1g/LBSA以及1g/LNaN3的10ml50mmol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液中制成微球浓度为10mg/ml的重组蛋白A蛋白G融合蛋白包被的聚苯乙烯微球悬浮液，储存在2-8℃备用。


5.如权利要求1所述的肝细胞生长因子胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：周金池，王兰珍，
申请(专利权)人：王兰珍，北京赛诺浦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11