一种检测线粒体基因组开放状态的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测线粒体基因组开放状态的方法，特点是包括以下步骤：(1)通过差速离心法分离纯度线粒体；(2)将纯化后的线粒体经甲醛交联后用微球菌核酸酶进行酶切，得到与蛋白结合的线粒体基因片段；(3)将与蛋白结合的线粒体基因片段分离和纯化；(4)利用二代测序技术对纯化后的基因片段进行测序，得到线粒体基因的开放序列图谱，优点是对线粒体DNA的开放状态进行鉴定，操作简单且耗时短。

A method to detect the open state of mitochondrial genome

【技术实现步骤摘要】
一种检测线粒体基因组开放状态的方法
本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种检测线粒体基因组开放状态的方法。
技术介绍
线粒体作为能量代谢的中心，是细胞中极为重要的细胞器之一。线粒体为双层膜结构，内膜与膜间隙中含有大量呼吸链相关蛋白，基质内含有遗传物质。人线粒体遗传物质(mtDNA)是大小为16.6Kb左右的双链环状DNA分子，由于碱基含量不同，富含鸟嘌呤的称为重链，富含胞嘧啶的称为轻链。线粒体DNA含有37个基因区段，其中重链编码12个呼吸链相关蛋白，14个tRNA以及2个rRNA；轻链编码1个呼吸链相关蛋白以及8个tRNA。尽管线粒体作为环状DNA分子，没有与核小体相互结合形成染色质的结构。但线粒体表面仍然存在许多蛋白与其结合，形成一个类似于拟核的结构。这些附着于线粒体上的蛋白一方面作为转录因子，参与线粒体DNA的转录；另一方面，这些蛋白还通过改变结合的比例来调控线粒体DNA的复制活性。现已探明，这类蛋白主要为线粒体转录因子TFAM。当TFAM等蛋白的含量升高时，线粒体开放状态下降，复制/转录活性降低；而当TFAM等蛋白的含量降低时，线粒体逐渐开放，复制/转录活性升高。理论上，任何能有效区分染色质开放状态的技术和方法均可用于鉴定线粒体基因的开放性。目前，关于检测染色质开放状态的方法包括：基于DNaseI(脱氧核糖核酸酶I的脱氧核糖核酸酶I酶切测序法(DNase-seq)，基于染色质免疫共沉淀的结合位点分析法(CHIP-seq)以及基于转座子插入的利用转座酶研究染色质可进入性的高通量测序技术(ATAC-seq)等。这些方法的原理较为相似但略有不同，总的来说就是利用酶切、超声等手段将染色质打断后，纯化分离出目标片段，随后利用第二代高通量测序技术对捕获的片段进行扩增、测序，从而获得目标序列的基因图谱。尽管上述方法在检测核基因组开放性方面已取得成功，但尚无法对线粒体基因组的开放性进行检测。DNaseI有较强的核基因偏好性，且操作繁琐，耗时长，不适合用作检测线粒体基因组。同时，由于超声波的打断力度较大，而蛋白与线粒体DNA的连接并不像核小体那样紧密，因此很容易造成蛋白与基因脱离，影响测序结果。而转座酶虽然剪切效率高，但对小片段的分辨能力不足，无法满足对线粒体检测的需要。微球菌核酸酶(micrococcalnuclease，MNase)作为一种非特异性的核酸酶，可对所有相邻核小体之间的裸露DNA进行切割，而与被核小体包裹的片段则不被切割降解。因此，经过微球菌核酸酶处理后，染色质可被分为有核小体蛋白包裹的部分和未被包括的开放部分，但上述几种方法的对象均为核基因组，未针对线粒体基因组进行优化，并把线粒体的基因组视为噪音，将其在建库过程中去除。目前，国内外还没有公开任何关于检测线粒体基因组开放状态的方法的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种对线粒体DNA的开放状态进行鉴定，具有操作简单、耗时短且不需要特殊仪器的检测线粒体基因组开放状态的方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测线粒体基因组开放状态的方法，包括以下步骤：(1)通过差速离心法分离纯度线粒体；(2)将纯化后的线粒体经甲醛交联后用微球菌核酸酶进行酶切，得到与蛋白结合的线粒体基因片段；(3)将与蛋白结合的线粒体基因片段分离和纯化；(4)利用二代测序技术对纯化后的基因片段进行测序，得到线粒体基因的开放序列图谱。步骤(1)具体过程如下：1)将含有人精子细胞的离心管放置于冰上，用细胞线粒体分离试剂盒分离线粒体，收集细胞沉淀；2)在含有细胞沉淀的试管中加入800μL试剂A，涡旋震荡5秒后放置冰水孵育2分钟后，加入10μL试剂B，涡旋震荡5秒，冰上孵育5分钟，然后加入800μL试剂C，反复吹打混匀，700g离心10分钟，取上清液；3)将上清液转移到新的离心管中，在4000g转速下，离心15分钟，去除上清，取沉淀即为纯化的线粒体；其中所述的试剂A、所述的B和所述的C均为试剂盒配套试剂。步骤(2)具体过程如下：在步骤(1)纯化的线粒体中加入28μL37wt％甲醛溶液，于37℃孵育15分钟；然后加入141μL125mM甘氨酸溶液，室温孵育5分钟后，在3000g转速下，于4℃离心5分钟后，去除上清液，用1mL预冷的PBS缓冲液轻轻重悬洗涤线粒体沉淀，再次在3000g转速下，于4℃离心5分钟后，去除上清液后，在沉淀中加入1mL线粒体裂解液，重新悬浮线粒体沉淀，在3000g转速下，于4℃离心15分钟后，去除上清液后，在沉淀中加入150μL线粒体裂解液重新悬浮线粒体沉淀后，加入0.5单位微球菌核酸酶和100单位核酸外切酶III，37℃孵育15分钟，消化完成得到线粒体消化液，即与蛋白结合的线粒体基因片段；所述的线粒体裂解液的配制方法如下：将500μL1MTris-HCl溶液、40μL1MMgCl2溶液，10μL1MCaCl2溶液、100μL100mMDTT溶液、7.5μLNP-40裂解液、100μL100X蛋白酶抑制剂和9.24mLddH20混合得到。步骤(3)具体过程如下：将步骤(2)得到的线粒体消化液立即加入到500μL2wt％SDS溶液中，于65℃孵育10分钟后，加入100μLTris-HCl-KCl缓冲液，4℃孵育5分钟后，在10000rpm转速下，于4℃离心5分钟，离心结束后去除上清液，在沉淀中加入1mL洗涤缓冲液重新悬浮线粒体，于65℃孵育10分钟，再在10000rpm转速下，于4℃下离心5分钟，去除上清液，在沉淀中加入100μL洗涤缓冲液，再加入1μL20μg/μL蛋白酶K溶液，涡旋混匀，于5℃孵育6小时后，在12000g转速下，于4℃离心2分钟后，取上清液，即得到经纯化的蛋白结合线粒体基因片段。所述的Tris-HCl-KCl缓冲液的配制方法如下：由1MTris-HCl溶液和1MKCl溶液按体积比1∶50混合后调pH至7.5得到；所述的洗涤缓冲液配制方法如下：将1mL1MKCl溶液、2μL0.5MEDTA溶液、200μL1MTris-HCl溶液和8.8mLddH2O混合得到。步骤(4)具体过程如下：将步骤3得到的上清液经纯化、添加接头以及体外扩增，经质量检测后上机测序，所测得的基因序列即代表线粒体基因组与蛋白结合的片段，将测序结果与线粒体基因组进行比对，根据线粒体基因组与蛋白结合片段占线粒体基因组的比例，判断线粒体基因组开放状态。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了一种检测线粒体基因组开放状态的方法，该方法利用线粒体核酸酶对小片段的高度敏感性，将提取出的线粒体与微球菌核酸酶作用后，再利用其它核酸酶将未与蛋白结合的DNA片段降解，纯化分离出与蛋白结合的部分，最后利用二代测序技术对所的片段进行测序，便可得到线粒体基因的开放图谱，无核基因与线粒体基因偏好的特性，可以很好的对线粒体DNA的开放状态进行鉴定，具有操作简单、耗时短，不需要特殊的仪器设备。本专利技术在微球菌核酸酶测序法的基础上，改良方法并转变使用场景，将原本用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测线粒体基因组开放状态的方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)通过差速离心法分离纯度线粒体；/n(2)将纯化后的线粒体经甲醛交联后用微球菌核酸酶进行酶切，得到与蛋白结合的线粒体基因片段；/n(3)将与蛋白结合的线粒体基因片段分离和纯化；/n(4)利用二代测序技术对纯化后的基因片段进行测序，得到线粒体基因的开放序列图谱。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测线粒体基因组开放状态的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)通过差速离心法分离纯度线粒体；
(2)将纯化后的线粒体经甲醛交联后用微球菌核酸酶进行酶切，得到与蛋白结合的线粒体基因片段；
(3)将与蛋白结合的线粒体基因片段分离和纯化；
(4)利用二代测序技术对纯化后的基因片段进行测序，得到线粒体基因的开放序列图谱。


2.根据权利要求1所示的一种检测线粒体基因组开放状态的方法，其特征在于步骤(1)具体过程如下：
1)将含有人精子细胞的离心管放置于冰上，用细胞线粒体分离试剂盒分离线粒体，收集细胞沉淀；
2)在含有细胞沉淀的试管中加入800μL试剂A，涡旋震荡5秒后放置冰水孵育2分钟后，加入10μL试剂B，涡旋震荡5秒，冰上孵育5分钟，然后加入800μL试剂C，反复吹打混匀，700g离心10分钟，取上清液；
3)将上清液转移到新的离心管中，在4000g转速下，离心15分钟，去除上清，取沉淀即为纯化的线粒体；其中所述的试剂A、所述的B和所述的C均为试剂盒配套试剂。


3.根据权利要求2所示的一种检测线粒体基因组开放状态的方法，其特征在于步骤(2)具体过程如下：
在步骤(1)纯化的线粒体中加入28μL37wt％甲醛溶液，于37℃孵育15分钟；然后加入141μL125mM甘氨酸溶液，室温孵育5分钟后，在3000g转速下，于4℃离心5分钟后，去除上清液，用1mL预冷的PBS缓冲液轻轻重悬洗涤线粒体沉淀，再次在3000g转速下，于4℃离心5分钟后，去除上清液后，在沉淀中加入1mL线粒体裂解液，重新悬浮线粒体沉淀，在3000g转速下，于4℃离心15分钟后，去除上清液后，在沉淀中加入150μL线粒体裂解液重新悬浮线粒体沉淀后，加入0.5单位微球菌核酸酶和100单位核酸外切酶III，37℃孵育15分钟，消化完成得到线粒体消化液，即与蛋白结合的线粒体基因片段。


4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛金锋，薛志刚，齐凌彬，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31