基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法技术

技术编号:24325431 阅读:14 留言:0更新日期:2020-05-29 17:57
本发明专利技术公开基于纳米孔测序同时检测片段化核酸变异和甲基化的方法。本发明专利技术通过使用串联接头设计,解决了样品起始量不足的问题,可以将碎片化的核酸连接成长片段,大大提高纳米孔的利用率、有效读长和总体数据量,在检测核酸突变的同时还可进行修饰信息的获取,使得降解或片段化严重的核酸样品特别是肿瘤和液体活检样品中的DNA可以在纳米孔平台进行测序。

Detection of DNA mutation and methylation based on nanopore sequencing

【技术实现步骤摘要】
基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法
本专利技术涉及基因测序领域,具体地涉及一种基于符合纳米孔测序质控标准的串联核酸片段进行片段化核酸小分子检测的方法。
技术介绍
纳米孔测序技术具有长读长、直接读取修饰信息和实时数据生产并行分析的特点,在长片段核酸检测变异(包括但不仅限于点突变、插入缺失、倒位易位、基因融合、RNA异常剪切、RNA编辑等多种核酸相关变异)和修饰信息(包括但不仅限于甲基化、乙酰化等)检测方面比二代测序或其他测序平台有更明显优势。该平台支持数据生产和分析并行的特点实现了实时变异/修饰检出和诊断,加上便携式的设计,成为床前快速诊断和监控的优势候选技术。医学肿瘤样本核酸如cfDNA/RNA、FFPE等,核酸片段化严重(通常在200bp或以下)且通常总量偏低,单独以低起始量短片段进行建库和纳米孔测序,在有效纳米孔利用率、数据产量、数据质量和检测成本上无法体现出该平台的优势。基于纳米孔测序技术,DNA单链通过纳米孔的速度(~500bp/秒)会对测序的精度和有效性造成较大影响,短片段(<500bp)的测序质量偏低或无法有效读取,所以直接将肿瘤样品中获得的片段化DNA,特别是cfDNA(片段分布通常<200bp)建库测序会导致数据质量过低或测序失败,直接影响到该平台在片段化严重的核酸测序应用。
技术实现思路
针对现有技术中的至少部分技术问题,专利技术人提供一种基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法。具体地,本专利技术包括以下内容。一种基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,其包括以下步骤:(1)处理样品得到含有不同长度的非均一性片段化核酸的混合物;(2)通过末端修复或通过单链连接反应在所述片段化核酸的末端加串联接头,其中,所述串联接头由标签序列、酶切位点和保护碱基组成,且所述串联接头的长度为15-30bp;(3)使连接有所述串联接头后的核酸组成的文库直接进行平端混合串联连接,或通过酶切位点组合进行粘端有方向性的连接;和(4)控制连接反应条件形成具有三代测序读长的连接产物,经纯化分选,分选得到符合纳米孔测序质控标准的串联核酸片段,然后进行纳米孔建库和测序,其中,所述串联核酸片段包含线性连接的多个短片段序列和位于各短片段序列至少一个末端的串联接头。根据本专利技术基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,优选地,所述多个短片段序列各自的长度分别为50-300bp,所述串联核酸片段的长度为1Kb-1Mb。根据本专利技术基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,优选地,所述多个短片段序列具有不同的碱基序列,且各短片段序列之间通过所述串联接头连接。根据本专利技术基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,优选地,所述串联核酸片段进一步包括引物结合区,其中所述引物结合区位于所述串联核酸片段的至少一个末端,或者所述引物结合区的至少一部分位于串联接头内。根据本专利技术基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,优选地,所述串联核酸片段进一步包括单链特异序列探针,其连接至所述串联核酸片段的至少一个末端,或连接至所述串联接头的至少一个末端。根据本专利技术基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,优选地,所述多个短片段序列包括来源于第一样品的短片段序列和来源于第二样品的短片段序列,其中,来源于第一样品的短片段序列与第一串联接头连接,来源于第二样品的短片段序列与第二串联接头连接,第一串联接头和第二串联接头具有不同的标签序列。根据本专利技术基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,优选地,所述片段化核酸为来源于手术或穿刺组织的FFPE或体液的cfDNA。根据本专利技术基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,优选地,在步骤(3)和(4)之间进一步包括利用针对目标区域的探针捕获靶序列,对靶序列进行扩增,然后串联连接得到串联核酸片段。根据本专利技术基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,优选地,在步骤(3)和(4)之间进一步包括利用针对目标区域的探针捕获靶序列,使靶片段与串联接头连接,对得到的带串联接头的靶片段进行扩增,然后串联连接得到串联核酸片段。本专利技术通过使用串联接头设计,解决了样品起始量不足的问题,可以将碎片化的核酸连接成长片段(>1kb)通过纳米孔,大大提高纳米孔的利用率、有效读长和总体数据量,同时获取了片段化核酸的修饰信息。使得降解或片段化严重的核酸样品,特别是肿瘤和液体活检样品中的DNA可以在纳米孔平台进行测序。数据产出后利用串联接头上的标签设计可以将多样本数据进行拆分,可以实现检测通量成数量级增加,降低单样品的检测成本,同时加上纳米孔接头自带的标签信息,利用双重标签降噪也有效降低样品间的交叉污染比率。附图说明图1拆分后序列结构和各区段位置分布图。图2甲基化位点信号图。其为某一拆分序列(reads_00025981-8a91-48c5-9e83-e804e8184ffc)上甲基化碱基分布和修饰信号强度分布图。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本专利技术的限制,而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本专利技术。另外,对于本专利技术中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料,但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。除非另有说明,否则“%”为基于重量的百分数。本专利技术中,“纳米孔测序质控标准”是指在纳米孔测序时对于样品质量控制的标准,其包括单位时间总数据产量和数据平均质量等,特别地还包括对于核酸长度的要求,其一般为1Kb以上,优选2Kb以上,更优选5Kb以上,例如1Mb。本专利技术中,串联接头为用于连接多个短片段的接头,每个串联接头由标签序列、酶切位点和保护碱基组成。在一个串联核酸片段中一般包含一个以上,例如2、4、6、8、10、15、20个或以上的串联接头。每个串联核酸片段中的各串连接头可以相同,也可以不同。各串联接头的长度一般为15-30bp,优选16-28bp,更优选18-25bp。需要说明的是,该长度可根据需要而变化,在特殊情况下也可以低于15bp或高于30bp。本专利技术中,串联核酸片段中的短片段可以是长度在10-500bp,例如20-300bp,50-200bp之间的任何片段。在一个串联核酸片段中短本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,其特征在于,包括以下步骤:/n(1) 处理样品得到含有不同长度的非均一性片段化核酸的混合物;/n(2) 通过末端修复或通过单链连接反应在所述片段化核酸的末端加串联接头,其中,所述串联接头由标签序列、酶切位点和保护碱基组成,且所述串联接头的长度为15-30bp;/n(3) 使连接有所述串联接头后的核酸组成的文库直接进行平端混合串联连接,或通过酶切位点组合进行粘端有方向性的连接;和/n(4) 控制连接反应条件形成具有三代测序读长的连接产物,经纯化分选,分选得到符合纳米孔测序质控标准的串联核酸片段,然后进行纳米孔建库和测序,其中,所述串联核酸片段包含线性连接的多个短片段序列和位于各短片段序列至少一个末端的串联接头。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)处理样品得到含有不同长度的非均一性片段化核酸的混合物;
(2)通过末端修复或通过单链连接反应在所述片段化核酸的末端加串联接头,其中,所述串联接头由标签序列、酶切位点和保护碱基组成,且所述串联接头的长度为15-30bp;
(3)使连接有所述串联接头后的核酸组成的文库直接进行平端混合串联连接,或通过酶切位点组合进行粘端有方向性的连接;和
(4)控制连接反应条件形成具有三代测序读长的连接产物,经纯化分选,分选得到符合纳米孔测序质控标准的串联核酸片段,然后进行纳米孔建库和测序,其中,所述串联核酸片段包含线性连接的多个短片段序列和位于各短片段序列至少一个末端的串联接头。


2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述多个短片段序列各自的长度分别为50-300bp,所述串联核酸片段的长度为1Kb-1Mb。


3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,各短片段序列之间通过所述串联接头连接。


4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述串联核酸片段进一步包括引物结合区,其中所述引物结合区位于所述串联核...

【专利技术属性】
技术研发人员:王伟伟孙雪宋蕾田埂
申请(专利权)人:元码基因科技北京股份有限公司
类型:发明
国别省市:北京;11

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