本发明专利技术公开了一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，该方法包括如下步骤：（1）收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；（2）将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA‑F、TetA‑R、TetB‑F、TetB‑R、TetD‑F和TetD‑R共同混合后，进行PCR扩增；（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并测序。本发明专利技术的检测方法敏感、特异、快速，可以检测极微量的目的基因，而不需要费时的副溶血弧菌培养。
【技术实现步骤摘要】
一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法
本专利技术属于涉及一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法。技术背景四环素类抗生素包括金霉素、土霉素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等。四环素类抗生素为广谱抑菌剂，对革兰阳性菌、革兰阴性菌以及厌氧菌，多数立克次体属、支原体属、衣原体属、非典型分枝杆菌属、螺旋体敏感。国内外研究表明，由于四环素药物长期和大量使用，副溶血弧菌对四环素类药物的耐药性十分严重，对人体健康构成威胁。已经发现的四环素耐药基因有：TetA,TetB,TetC,TetD,TetE,TetG等。目前我国传统四环素药耐药性检测是通过测定副溶血弧菌最低抑菌浓度或抑菌圈大小测定副溶血弧菌的耐药性，必须经过繁琐的副溶血弧菌分离纯化、繁殖扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于及时的选药治疗。由于药敏试验是在体外用药物试探性的检验副溶血弧菌的表型耐药特性，不能检测副溶血弧菌的隐型耐药性。
技术实现思路
本专利技术提供一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法。本专利技术的具体技术方案如下：（1）收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~15min后收集上清液，得到模板。（2）将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.3~0.4mmol/L的dNTP、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-R、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-R、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-F、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-R和终浓度为0.05~0.08U/uL的TaqDNA聚合酶，其中TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R分别如SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5和SEQID6，上述PCR缓冲液的10倍母液中包括30~40mM氯化钠、pH8.3的15mMTris-HCl、0.01~0.02%甘油和0.05~0.08%硫酸铵，30~40mMMgCl2；（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并测序。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.35mmol/L的dNTP、终浓度为0.35mmol/L的TetA-F、终浓度为0.35mmol/L的TetA-R、终浓度为0.35mmol/L的TetB-F、终浓度为0.35mmol/L的TetB-R、终浓度为0.55mmol/L的TetD-F、终浓度为0.55mmol/L的TetD-R和终浓度为0.06U/uL的TaqDNA聚合酶。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述PCR缓冲液的10倍母液中包括35mM氯化钠、pH8.3的15mMTris-HCl、0.01%甘油和0.06%硫酸铵，35mMMgCl2。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应条件如下：90~95℃预变性8~12min，然后进入如下循环：94~95℃变性50~60s、54~55℃退火1~1.2min、72~74℃延伸45~50s，共30~35个循环，循环结束后于72℃延伸8~10min，2~4℃保存。进一步优选的，所述PCR扩增的反应条件如下：93℃预变性10min，然后进入如下循环：94℃变性60s、54℃退火1min、74℃延伸45s，共30个循环，循环结束后于72℃延伸10min，4℃保存。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤（3）的电泳条件为：2%琼脂糖凝胶，80V电压，时间40min。本专利技术的特点：1、本专利技术的检测方法敏感、特异、快速，可以检测极微量的目的基因，而不需要费时的副溶血弧菌培养；2、本专利技术的检测方法在同一反应体系中加入多对引物对多个四环素耐药基因同时进行扩增，在检测基因过程中可设立内部对照；可指示出模板的数量；可同时扩增几个目的基因：消耗的时间和试剂少，减少准备时间提高效率；可大量地进行样品和目的基因的检测。附图说明图1为本专利技术实施例1电泳结果，可见450bp左右、650bp左右、550bp左右的条带，分别指示TetA基因、TetB基因、TetD基因。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1（1）LB培养基摇瓶培养增殖副溶血弧菌，摇瓶培养条件为33℃，24h，120rpm，摇瓶培养结束后离心收集副溶血弧菌活菌体0.8g，用8mL去离子水重悬，反复冻融5次破碎细胞，12000rpm离心10min后收集上清液，得到模板；（2）将该5uL模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R（引物浓度分别为25mmol/L，用1mMTris-HCl--0.1mMEDTA缓冲液稀释）共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.35mmol/L的dNTP、终浓度为0.35mmol/L的TetA-F、终浓度为0.35mmol/L的TetA-R、终浓度为0.35mmol/L的TetB-F、终浓度为0.35mmol/L的TetB-R、终浓度为0.55mmol/L的TetD-F、终浓度为0.55mmol/L的TetD-R和终浓度为0.06U/uL的TaqDNA聚合酶，其中TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R分别如SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5和SEQID6，上述PCR缓冲液的10倍母液中包括35mM氯化钠、pH8.3的15mMTris-HCl、0.01%甘油和0.06%硫酸铵，35mMMgCl2；上述PCR扩增的反应体系为50uL，反应条件如下：93℃预变性10min，然后进入如下循环：94℃变性60s、54℃退火1min、74℃延伸45s，共30个循环，循环结束后于72℃延伸10min，4℃保存；（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，取5uLPCR产物，与1uLLoadingbuffer混匀后，点样于2%琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，电泳结果如图1所示，结果可见450bp左右、650bp左右、550bp左右的条带，分别指示TetA基因、TetB基因、TetD基因。同时将经过纯化的PCR产物50uL和20uL三基因的上下游引物一起测序。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，其特征包括如下步骤：/n（1）收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；/n（2）将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.3~0.4mmol/L的dNTP、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-R、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-R、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-F、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-R和终浓度为0.05~0.08U/uL的TaqDNA聚合酶，其中TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R分别如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR缓冲液的10倍母液中包括30~40mM氯化钠、pH8.3的15mMTris-HCl、0.01~0.02%甘油和0.05~0.08%硫酸铵，30~40mM MgCl...
【技术特征摘要】
1.一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，其特征包括如下步骤：
（1）收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；
（2）将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.3~0.4mmol/L的dNTP、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetA-R、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-F、终浓度为0.3~0.4mmol/L的TetB-R、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-F、终浓度为0.5~0.6mmol/L的TetD-R和终浓度为0.05~0.08U/uL的TaqDNA聚合酶，其中TetA-F、TetA-R、TetB-F、TetB-R、TetD-F和TetD-R分别如SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5和SEQID6，上述PCR缓冲液的10倍母液中包括30~40mM氯化钠、pH8.3的15mMTris-HCl、0.01~0.02%甘油和0.05~0.08%硫酸铵，30~40mMMgCl2；
（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。
2.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌四环素类药物耐药性检测方法，其特征在于：所述步骤（1）为：收集副溶血弧菌活菌体0.6~0.8g，用6~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~15min后收集上清液，得到模板。
3.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄升谋，
申请(专利权)人：湖北文理学院，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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