一种冠突散囊菌及从其中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法技术

本发明专利技术公开了一种冠突散囊菌Eurotium cristatum XD‑05，保藏编号为CGMCC No.19024。另外，本发明专利技术还公开了从冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法。本发明专利技术的冠突散囊菌菌株来源于茯砖茶，该菌株生态安全，本发明专利技术首次从茯茶来源的冠突散囊菌中分离纯化出二酮哌嗪二聚体，分离纯化方法简单高效，分离纯化的二酮哌嗪二聚体纯度达98％以上。

A method of isolating and purifying diketpiperazine dimer

【技术实现步骤摘要】
一种冠突散囊菌及从其中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种冠突散囊菌及从其中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法。
技术介绍
茯砖茶在我国历史上源远流长，从原来的纯手工制作到现代化的机器制茶，从清朝时期只供给特殊人群享用的“官茶”到现在的边销茶，从原来只有在陕西才能生产的特产茶到现在可以在全国生产的茶叶，但茯砖茶是经过“发花”工艺制成的这一点却是亘古不变的，因此在各类茶类饮用品中茯砖茶才会独树一帜。茯砖茶不仅能补充人体所需的一些特殊物质，而且能够降低人体血脂、血糖，并有减肥等功效。研究表明：茯砖茶中的优势微生物是冠突散囊菌，“金花”实际上是该菌产生的黄色闭囊壳。文献(PhytochemistryLetters,2012,5,717–720)报道分离出了一种新化合物为二酮哌嗪二聚体，其来源于海洋海绵上的冠突散囊菌(EurotiumcristatumKUFC7356)其特点是菌落整体为淡橘色，且呈不规则放射状圆形(如图1)。但文献中并未对二酮哌嗪二聚体有进一步的研究。二酮哌嗪类化合物(Diketopiperazines,DKPs)的基本结构是由2个氨基酸缩合而成的环二肽(DKP),因其骨架具有稳定的六元环结构,且有2个氢键给体和2个氢键受体,使得DKPs在药物化学中成为一个重要的药效团,且它们的研究也为多肽化学方向研究奠定了基础。目前海绵共生微生物中已经发现了大量的活性DKPs，而在茯茶来源的冠突散囊菌中目前很少有发现DKPs。本实验室研究发现：来源于茯茶的冠突散囊菌也能产生二酮哌嗪二聚体，并且其对糖代谢有明显的调节作用，但目前对于茯茶来源的冠突散囊菌中二酮哌嗪二聚体的制备方法尚无文献报道。因此采用现代分离纯化方法制备二酮哌嗪二聚体，将其应用于二酮哌嗪二聚体单体化合物的多种药理活性研究具有非常重要的价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种冠突散囊菌。该菌株来源于茯茶，生态安全，生物活性高，且有明显的降糖降脂等活性功能，可作为一株高活性、高产次级代谢产物的菌株。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种冠突散囊菌，其特征在于，所述冠突散囊菌为EurotiumcristatumXD-05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19024，保藏日为2019年11月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。1、该菌株具有如下的性质：形态特征：将其接种于PDA固体平板上，28℃培养24h就可看到白色绒状菌落，48h菌落直径可达15mm，菌落中心位置菌丝开始变黄。72h整个菌落呈亮黄色，直径可达45-50mm。继续培养至144h菌落中央部位有黑褐色渗出液，整个菌落呈褐色，培养基背面也有褐色色素存在，菌落直径50-55mm。将其接种至察氏培养基中菌落形态同PDA平板中基本相同，但生长较慢，最终菌落直径也小，在35-40mm。生理生化特征：本菌株好气性强，耐剪切性差，搅拌转速超过300rpm时菌丝易断裂，生长变慢。生长的pH范围4.0-7.0，最适pH为6.0。最高生长温度38℃，最适生长温度28℃。该菌株可以利用多种碳源，但最佳碳源为蔗糖；可以利用多种氮源，无机氮源较差，有机氮源中以酵母粉为最佳。2、该菌株的筛选方法包括：步骤一、富集：将10g茯砖茶磨成粉末，用生理盐水制成悬液，采用稀释涂布平板法的方法将上述悬液按照10倍进行梯度稀释，并涂布平板，挑取菌落较大而且颜色呈亮黄色的菌落为冠突散囊菌孢子；步骤二、初筛和纯化：将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，孢子活力为1*107cfu/mL，取600～800μL接种到PDA平板上培养，在25～38℃恒温培养箱内培养5天后收取得到金黄色孢子；步骤三、复筛：将上一步所得到的孢子划线于含有PDA平板继续筛选8-10代，PDA斜面培养，置于4℃保藏。进一步地，本专利技术还提供了一种从上述的冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备冠突散囊菌孢子；步骤二、浸提步骤一中制备的冠突散囊菌孢子，得到孢子浸提液；步骤三、采用大孔吸附树脂对步骤二中所述孢子浸提液进行吸附，然后进行梯度洗脱，收集目标段洗脱液；步骤四、利用反相高效液相色谱分离纯化步骤三中收集的目标段洗脱液，收集最大色谱峰的洗脱液，浓缩后冻干，得到二酮哌嗪二聚体。上述的方法，其特征在于，步骤一中冠突散囊菌孢子的制备方法为：将冠突散囊菌接种到PDA平板上，培养5～7天，挑取冠突散囊菌孢子，将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，接种到PDA平板上，5～7天后收取得到金黄色冠突散囊菌孢子。上述的方法，其特征在于，步骤二中浸提所用溶剂为水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮和乙醚中的一种或几种，所述溶剂的体积与冠突散囊菌孢子的质量之比为(10～100):1，其中体积的单位为mL，质量的单位为g。上述的方法，其特征在于，浸提所用溶剂为乙醇和水的混合溶液。上述的方法，其特征在于，所述乙醇和水的混合溶液中乙醇的体积百分含量为50％。上述的方法，其特征在于，步骤三中所述大孔吸附树脂的型号为S-8、AB-8、D-101、X-5、NRR或D-3520。上述的方法，其特征在于，步骤三中梯度洗脱采用的洗脱液为乙醇水溶液。上述的方法，其特征在于，步骤四中反相高效液相色谱采用XDB-C18反相色谱柱，流动相为体积百分比浓度为25％～45％的乙醇水溶液。本专利技术分离纯化得到的二酮哌嗪二聚体的结构式如式下所示：本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、本专利技术的冠突散囊菌菌株来源于茯茶，该菌株生态安全。2、本专利技术的冠突散囊菌菌株生物活性高，且有明显的降糖降脂等活性功能，可作为一株高活性、高产次级代谢产物的菌株。3、本专利技术首次从茯茶来源的冠突散囊菌中分离纯化出二酮哌嗪二聚体，分离纯化方法简单高效，分离纯化的二酮哌嗪二聚体纯度达98％以上。4、本专利技术在分离纯化过程中所使用的溶剂均廉价易得，且纯化工艺简单经济高效，有很高的工业应用价值。下面通过实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。附图说明图1为海洋海绵上的冠突散囊菌菌落的形态图。图2为本专利技术的冠突散囊菌EurotiumcristatumXD-05的形态图。图3为本专利技术实施例2分离纯化的二酮哌嗪二聚体的ESI/MS光谱(负离子)谱图。图4为本专利技术实施例2分离纯化的二酮哌嗪二聚体的ESI/MS光谱(正离子)谱图。图5为本专利技术实施例2分离纯化的二酮哌嗪二聚体的1HNMR光谱图。图6为本专利技术实施例2分离纯化的二酮哌嗪二聚体的13CNMR光谱图。图7为本专利技术实施例2分离纯化的二酮哌嗪二聚体的高效液相色谱图。图8为本专利技术分离纯化的二酮哌嗪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冠突散囊菌，其特征在于，所述冠突散囊菌为Eurotiumcristatum XD-05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19024。/n

【技术特征摘要】
1.一种冠突散囊菌，其特征在于，所述冠突散囊菌为EurotiumcristatumXD-05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19024。


2.一种从权利要求1所述的冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备冠突散囊菌孢子；
步骤二、浸提步骤一中制备的冠突散囊菌孢子，得到孢子浸提液；
步骤三、采用大孔吸附树脂对步骤二中所述孢子浸提液进行吸附，然后进行梯度洗脱，收集目标段洗脱液；
步骤四、利用反相高效液相色谱分离纯化步骤三中收集的目标段洗脱液，收集最大色谱峰的洗脱液，浓缩后冻干，得到二酮哌嗪二聚体。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中冠突散囊菌孢子的制备方法为：将冠突散囊菌接种到PDA平板上，培养5～7天，挑取冠突散囊菌孢子，将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，接种到PDA平板上，5～7天后收取得到金黄色冠突散囊菌孢子...

【专利技术属性】
技术研发人员：范代娣，朱晨辉，刘刚，惠俊峰，张慧，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61