本发明专利技术公开了一种卷枝毛霉MF‑8及其提高土茯苓中花旗松素含量的应用，将卷枝毛霉MF‑8经产酶培养的发酵液过滤，取滤液为粗酶液，加入经粉碎的土茯苓粉，在30‑35℃的振荡条下转化反应24‑36h，过滤除去粗酶液，滤饼经烘干，即得富含花旗松素的土茯苓。本发明专利技术筛选的卷枝毛霉MF‑8使土茯苓中的花旗松素含量提高幅度大，最高可达28.1倍，含量由原来的0.247mg/g提高到7.19mg/g；本发明专利技术具有专一性好，产物得率高，生物催化剂的成本低的优势，实现土茯苓中药效成分原位转化。
Mucor curlicum mf-8 and its application in increasing the content of Douglas fir in Smilax glabra
【技术实现步骤摘要】
卷枝毛霉MF-8及其提高土茯苓中花旗松素含量的应用(一)
本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种采用生物转化法提高土茯苓中花旗松素含量的方法。(二)
技术介绍
花旗松素(taxifolin)又名黄杉素、二氢槲皮素、紫杉叶素，分子式为C15H12O7，分子量为304.25，CAS号为480-18-2，化学名为3,5,7,3',4'–五羟基黄烷酮(3,5,7,3',4'-pentahydroxyflavanone)结构式见图1。研究表明，花旗松素在人体中具有多种活性，如选择性免疫抑制、抗炎、镇痛、抗菌、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等。花旗松素是食品工业的一种新的抗氧化剂，它的抗氧化能力可以与许多天然及合成的抗氧化剂相媲美，大剂量使用没有发现它有毒性反应，也没有实验发现它对胎儿有致畸、致过敏和致突变作用，可用作保健品或食品添加剂。2017年2月14日，欧盟食品安全局就落叶松提取物(花旗松素)作为新资源食品发布意见，批准富含花旗松素的落叶松提取物用作非酒精饮料、酸奶和巧克力糖果等的添加剂。目前，天然花旗松素只在紫杉、黄杉、落叶松中有发现，纹母树、野黑樱中也有极少量存在。因紫杉和黄杉已列入全球濒危树种禁止采伐，而落叶松只分布在俄罗斯西伯利亚东部、蒙古国东北部、中国东北地区和朝鲜，且生长周期较长，所以，用于提取生产花旗松素的资源极为稀少和匮乏。而它的糖苷，包括落新妇苷(astilbin，CAS号29838-67-3)、新落新妇苷(neoastilbin，CAS号54081-47-9)、异落新妇苷(isoastilbin，CAS号54081-48-0)、新异落新妇苷(neoisoastilbin，CAS号54141-72-9)在自然界广泛存在，特别是在土茯苓、紫荆花中含量较高，如《2015年药典》规定中药材土茯苓中落新妇苷的含量不得低于0.45％。所以，以落新妇苷为原料，水解切除二糖残基而转化为花旗松素，则是一条可行的生产方法。采用微生物发酵的含糖苷酶的粗酶液处理土茯苓，因粗酶液中含多种类型的糖苷酶，可以将土茯苓中所含的落新妇苷及其异构体都转化成花旗松素，其含量可大幅度提高，而且微生物发酵产生的多糖水解酶对植物组织结构的纤维素和半纤维素降解，使土茯苓植物组织疏松，从而有利于花旗松素的释放。经过转化处理的土茯苓，既可作为中药饮片应用于中药方剂；也可以作为花旗松素提取的原料，提取率将大幅度提高。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株产糖苷酶的微生物新菌株—卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)MF-8菌株，及其提高土茯苓中花旗松素含量的应用。经转化处理的土茯苓中，花旗松素的含量显著提高，可达7.19mg/g，工艺具有成本低、流程简单、转化率高等优点。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株—卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)MF-8，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60920，保藏日期2019年12月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510070。本专利技术所述卷枝毛霉MF-8菌株，是从中药材土茯苓的微生物富集培养物中分离，经过筛选得到的优良菌株，其核糖体18srDNA核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。所述卷枝毛霉MF-8的形态特征如下：在马铃薯琼脂平板培养基上，28℃条件下培养，菌落初期为灰白色绒毛状，1天后灰色略有加深，表面产生灰色孢子。光学显微镜下可以观察到分生孢子梗单生，繁密成层，直立，全部顶生孢子囊，孢子囊较大，球形，略带褐色，孢囊孢子球形，直径4–5μm。卷枝毛霉MF-8菌株在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图2。本专利技术还提供一种所述卷枝毛霉MF-8提高土茯苓中花旗松素含量的应用，所述应用的方法为：将卷枝毛霉MF-8经产酶培养的发酵液过滤，取滤液为粗酶液，加入经粉碎的土茯苓粉，在30–35℃的振荡条下转化反应24–36h，过滤除去粗酶液，滤饼经烘干，即得富含花旗松素的土茯苓。进一步，所述粗酶液的制备方法为：将卷枝毛霉MF-8接种于产酶培养基中，于28–30℃、150–200r/min恒温振荡条件下培养2–3d，将发酵液过滤，收集滤液，即为粗酶液；所述的产酶培养基终浓度组成为：落新妇苷1–2g/L，葡萄糖20–40g/L，酵母浸粉10–15g/L，蛋白胨5–10g/L，NaNO310–16g/L，KH2PO45g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，MnSO4·H2O0.5g/L，溶剂为自来水，初始pH5.0–7.0。进一步，优选所述产酶培养基组成为：落新妇苷1g/L，葡萄糖40g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，NaNO316g/L，KH2PO45g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，MnSO4·H2O0.5g/L，溶剂为自来水，pH6.5。进一步，所述转化反应条件为30–35℃、150–200r/min条件下振荡24–36h。进一步，所述粗酶液体积加入量以土茯苓重量计为10–50mL/g，所述土茯苓在加入前需粉碎过80目筛，粒径约为0.2mm。进一步，所述滤饼干燥条件为85–105℃、6–10h，优选85℃。具体的，所述利用卷枝毛霉MF–8糖苷酶提高土茯苓中花旗松素含量的方法为：将卷枝毛霉MF-8菌种孢子或经过扩大培养的种子液接种至产酶培养基中，28–30℃、150–200r/min振荡培养2–3d，过滤除去菌体，取滤液得粗酶液；向粗酶液中加入过80目筛的土茯苓颗粒，于30–35℃、150–200r/min条件下培养24–36h，过滤弃去粗酶液，滤饼经85–105℃烘干6–10h，即得富含花旗松素的土茯苓。本专利技术所述卷枝毛霉MF-8在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液接入产酶培养基进行产酶培养，所述卷枝毛霉MF-8产酶发酵培养方法为：(1)活化培养：将卷枝毛霉MF-8接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养2–3d，获得卷枝毛霉MF-8孢子；所述的PDA平板培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后卷枝毛霉MF-8孢子接种至种子培养基中，于28–30℃、150–200r/min恒温振荡条件下培养1–2d，得种子液；所述种子培养基组除不含琼脂外，成分和制备方法同步骤(1)中的PDA培养基；(3)产酶发酵培养：用步骤(1)活化培养后卷枝毛霉MF-8孢子，或步骤(2)制备的种子液按体积浓度3％–5％(优选5％)的接种量接入产酶培养基，于28–30℃、150–200r/min恒温振荡条件下培养2–3d，获得发酵液；所述产酶培养基终浓度组成为：落新妇苷1–2g/L，葡萄糖20–40g/L，酵母浸粉10–15g/L，蛋白胨5–10g/L，NaNO31本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.卷枝毛霉(Mucor circinelloides)MF-8，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60920，保藏日期2019年12月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510070。/n
【技术特征摘要】
1.卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)MF-8，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60920，保藏日期2019年12月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510070。
2.一种权利要求1所述卷枝毛霉MF-8提高土茯苓中花旗松素含量的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将卷枝毛霉MF-8经产酶培养的发酵液过滤，取滤液为粗酶液，加入经粉碎的土茯苓粉，在30–35℃的振荡条下转化反应24–36h，过滤除去粗酶液，滤饼经烘干，即得富含花旗松素的土茯苓。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化反应条件为30–35℃、150–200r/min条件下振荡24–36h。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述粗酶液体积加入量以土茯苓重量计为10–50mL/g，所述土茯苓在加入前需粉碎过80目筛。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述滤饼干燥条件为85–105℃、6–10h。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述粗酶液的制备方法为：将卷枝毛霉MF-8接种于产酶培养基中，于28–30℃、150–200r/min恒温振荡条件下培养2–3d，将发酵液过滤，收集滤液，即为粗酶液；所述的产酶培养基终浓度组成为：落新妇苷1–2g...
【专利技术属性】
技术研发人员：梅建凤，王萍萍，陈翔，陈才军，刘婷，应国清，易喻，
申请(专利权)人：浙江工业大学，舟山市食品药品检验检测研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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