一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用，属于生物医学工程领域和微生物工程领域。本发明专利技术在基于大肠杆菌胞内表达系统，对链球菌溶血素成熟蛋白全序列的核酸序列进行优化设计，在链球菌溶血素蛋白的两端分别融合GSSSSHHHHHHHHSS(GSHS)和SSHHHHHHSS(SHS)多肽片段后，表达蛋白的活性产量达到5×10

An engineering strain expressing streptolysin mature protein and its application

【技术实现步骤摘要】
一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用
本专利技术涉及一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用，属于生物医学工程领域和微生物工程领域。
技术介绍
链球菌溶血素蛋白是链球菌感染过程中的重要致病因子，能引起人和动物细胞膜产生穿孔，具有抗原性，能刺激人体产生抗体，抗体过量产生会导致关节等部位异常。在链球菌感染检测中，链球菌溶血素蛋白标品是一种重要试剂，在市场和临床中具有广泛的需求，在国内外制备的链球菌溶血素蛋白免疫试剂盒中，链球菌溶血素蛋白标品是链球菌溶血素蛋白免疫试剂盒的重要组分，目前国际上制备链球菌溶血素蛋白的产率较低。目前，链球菌溶血素蛋白来源一是通过天然链球菌提取，但产量较低；二是通过大肠杆菌重组表达。链球菌溶血素全长成熟蛋白不与有关标签融合表达的研究显示，表达蛋白稳定性好，在蛋白变性和非变性状态下均显示抗原性，但蛋白表达量低，为0.3mg/mL。之后，由于研究人员发现天然链球菌溶血素全蛋白的前77个氨基酸组成的肽段部分对大肠杆菌毒性较大，可能有抑制表达的效果，因而采取了表达其第77号氨基酸后续多肽片段的策略，总体蛋白表达量最大可达到3mg/mL，缺点是表达蛋白的比活相对较低，非活性蛋白较多，溶血活性产量为2.4×106HU/mL，说明表达的胞内蛋白有效折叠差，而且该表达的上清蛋白样品在-20和-80℃低温下直接保存的稳定性差，容易变性。为了进一步提高SLO的活性蛋白表达产量，前人用一种果胶酸裂解酶作为融合标签与77号氨基酸后续片段共同表达，表达产量达到4mg/mL，将酶活产量提高达4×107HU/mL，蛋白的产量胞内占比可达38％，但由于较大融合标签带来的的空间位阻作用，导致蛋白在非变性状态下，抗原决定基团暴露受影响，抗原性受到屏蔽。因此，目前还是缺少同时具备高活性蛋白表达、蛋白产品稳定性好和抗原性正常等条件的SLO表达工程菌。另外，在链球菌引起的疾病中，病原体释放的SLO必然是含全序列氨基酸的溶血素成熟蛋白，所以为医学临床SLO抗体检测提供的SLO蛋白还是含全序列氨基酸比较合理，所以优化全序列氨基酸的溶血素成熟蛋白的技术在临床上的价值高于优化77氨基酸后的溶血素蛋白片段，本专利提供满足表达链球菌溶素的全序列成熟蛋白、具备高活性蛋白表达、蛋白产品稳定性好和抗原性正常等条件的SLO表达工程菌，更合理和临床应用意义更大。
技术实现思路
本专利技术针对缺乏能够高效表达稳定性和抗原性俱佳的链球菌溶血素成熟蛋白全序列的质粒和工程菌，难以综合解决链球菌溶血素蛋白重组表达在成熟全序列表达、对宿主生长有影响、表达量低、稳定性低和抗原性缺失等方面的多种问题，提供了一种溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS及其表达质粒与应用。本专利技术提供了一种能够在大肠杆菌中高效表达的、蛋白稳定性与抗原性俱佳的链球菌溶血素蛋白，具有稳定性与抗原性俱佳，含GSSSSHHHHHHHHSS(GSHS)和SSHHHHHHSS(SHS)的双Tag，含有链球菌溶血素成熟蛋白氨基酸全序列，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了编码链球菌溶血素蛋白的基因GSHS-SLO-SHS，所述基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了一种表达所述链球菌溶血素蛋白或含有所述编码链球菌溶血素蛋白基因的表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体以pET-28a(+)为出发载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体pET-28a(+)中的第二个His-tag和Thrombin序列被删除。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术提供了一种表达所述链球菌溶血素蛋白GSHS-SLO-SHS的工程菌或细胞系。在本专利技术的一种实施方式中，所述工程菌或细胞系是以大肠杆菌为宿主，pET-28a(+)为载体，表达如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种制备链球菌溶血素蛋白的方法，所述方法是以表达链球菌溶血素蛋白GSHS-SLO-SHS的工程菌或细胞系为发酵菌株进行发酵产蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为将所述工程菌或细胞系接种在含80～200μg/mL卡那霉素的LB培养基中35～40℃培养过夜(12h～15h)，后接入TB发酵液体培养基，35～40℃培养到细菌OD600到0.7～1.0，用0.3～0.6mMIPTG诱导，降温至20～30℃培养，表达40～50h，得到发酵液，将发酵液进行纯化即得到链球菌溶血素蛋白。本专利技术提供了一种所述溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS在SLO蛋白生产、SLO抗体检测、SLO抗体制品制备等领域的应用。本专利技术的有益效果：综合解决了链球菌溶血素成熟蛋白全序列重组表达过程中的成熟蛋白全序列表达、影响宿主细胞生长、表达量低和稳定性差等问题。(1)提供了一种链球菌溶血素成熟蛋白全序列表达方法，本专利技术优化设计并合成了溶血素融合基因GSHS-slo-SHS，构建了含该GSHS-slo-SHS融合基因的表达质粒和含该表达质粒的工程菌，该工程菌可以表达溶血素融合蛋白(GSHS-SLO-SHS)。(2)GSHS-SLO-SHS对宿主细胞群体生长影响低。摇瓶发酵表达结果表明，溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS对宿主细胞毒性低，25℃条件下表达48h后，GSHS-slo-SHS/pET-28(a)工程菌OD600可以达到2.5，高于SLO独立表达的工程菌(OD600：1.60)；说明GSHS-SLO-SHS蛋白对宿主细胞群体生长影响低。(3)本专利技术的工程菌表达的溶血素融合蛋白GSHS-SLO-SHS具有较高溶血活性和蛋白产量。表达蛋白的活性产量达到5×107HU/mL，蛋白产量达到4mg/mL，胞内占比可达40％，而SLO全序列独立表达，表达产量低于0.3mg/mL。(4)GSHS-SLO-SHS蛋白的稳定性良好。蛋白制品可在-80℃条件下保存2年以上，稳定性保持在80％，SLO胞内独立表达，其蛋白纯化后在-80℃条件下保存时间1年，稳定性保持在40％。(5)GSHS-SLO-SHS蛋白抗原活性正常。具体实施方式以下通过实施例来进一步阐明本专利技术，下列实施例用于说明目的而非用于限制本专利技术范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。附图说明图1为设计的GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)质粒结构图。图2为GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)酶切鉴定图；泳道1为DNAMarker，泳道2为GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)/pET-28a，泳道3为GSHS-slo-SHS/pET-28a(+)双酶切。图3为重组表达GSHS-SLO-SHS的SDS-PAGE图谱；泳道1为蛋白Marker，泳道2为GSHS-slo-SHS/pET-28a的胞内上清。以下通过实施例来进一步阐明本专利技术，下列实施例用于说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种链球菌溶血素蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种链球菌溶血素蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.编码权利要求1所述链球菌溶血素蛋白的基因。


3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体表达权利要求1所述链球菌溶血素蛋白或含有权利要求2所述基因。


4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体以pET-28a(+)为出发载体。


5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体pET-28a(+)中的Thrombin和第二个His-tag被删除。


6.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：赵庆新，赵子润，朱华琛，康贻军，沈敏，刘忠权，
申请(专利权)人：盐城师范学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32