一种O-连接糖肽的分析方法技术

本发明专利技术涉及一种O‑连接糖基化的鉴定新方法。通过对糖肽质谱图进行计算机模拟去糖基化处理，将氨基酸位点层次的可变修饰提升到肽段层次，从而在数据库检索时避免了设置糖基化可变修饰，解决了传统方法检索空间大、搜索时间长、假阳性率高等问题，实现了O‑连接糖肽的高灵敏度鉴定。本发明专利技术具有大规模分析O‑连接糖肽的能力，在筛选基于糖蛋白的疾病标志物方面具有重要的应用潜力。

An analysis method of O-linked glycopeptide

【技术实现步骤摘要】
一种O-连接糖肽的分析方法
本专利技术属于蛋白质组学研究方向中糖基化蛋白质组学领域，具体涉及O-连接糖肽质谱数据的高灵敏度分析新方法。
技术介绍
糖基化(glycosylation)是一种十分普遍的蛋白质翻译后修饰，细胞中表达的蛋白超过50％的蛋白质为糖蛋白，糖蛋白参与了细胞识别、细胞分化、信号转导、细胞粘附、细胞凋亡、免疫应答等许多重要的生物学过程(You,X.,Qin,H.&Ye,M.J.Sep.Sci.41,248–261(2018))。蛋白质糖基化的异常会导致癌症、神经退行性疾病等诸多疾病，因此，糖基化可以作为某些疾病的生物标志物。目前临床上所用的疾病标志物大多数是糖基化蛋白质，如肝癌的标志物-甲胎蛋白(AFP)，前列腺癌标志物-前列腺特异抗原(PSA)等。因此，对于糖基化的深入研究具有非常重要的意义。近年来质谱技术得到了快速发展，主要表现在扫描速度更快，分辨率更高，质量精度更高，使得高效液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)在糖基化的大规模分析中得到了广泛应用。糖基化主要包括N-连接糖和O-连接糖。N-连接糖肽的肽段序列具有保守的序列特征(Asn-Xxx-Ser/Thr，Xxx≠Pro)，糖链部分则具有固定的五糖核心(Levery,S.B.etal.Acta-Gen.Subj.1850,33–42(2015))，使得N-连接糖肽的质谱图分析相对容易，保守的序列特征可用于鉴定到的肽段序列过滤，固定五糖核心会产生特征性的质谱峰，可用于识别N-连接糖肽谱图以及糖链部分。而O-连接糖肽则没有保守的肽段序列，且具有很高的宏观不均一性(位点占有率的变化范围很大)和微观不均一性(一个位点可以被多种糖型修饰)(Darula,Z.&Medzihradszky,K.F.Mol.Cell.Proteomics17,2–17(2018))。目前O-连接糖基化的质谱数据分析主要采用数据库检索的方式，将糖基化设置为可变修饰对蛋白序列库进行检索，由于O-连接糖基化的种类多，使得检索空间成指数增长，检索空间的增大一方面增加了检索时间，另一方面，也增加了随机匹配的概率，使得假阳性的结果增多、鉴定灵敏度下降。
技术实现思路
本专利技术提出的目的在于提供一种可以高灵敏度分析O-连接糖基化肽段的方法。通过对糖肽谱图进行去糖基化处理，将糖基化可变修饰从氨基酸位点层次提升到肽段层次，解决了传统数据库检索方法的检索空间过大的问题，实现了O-糖基化质谱图的高灵敏度鉴定。本专利技术采用如下的技术方案：取蛋白样品，将蛋白酶解，然后用PNGaseF酶去除N-糖链，用亲水材料(HILICtip)富集O-连接糖肽，随后使用LC-MS/MS对这些糖肽进行分析，最后对质谱数据进行O-连接糖肽的高灵敏度鉴定。其中质谱数据的分析流程为：(1)对质谱图进行质心化(centroiding)操作；(2)对待鉴定的O-连接糖进行排列组合，生成肽段上可能存在的糖基化的所有组合形式；(3)对质谱图进行过滤，保留糖肽谱图；(4)对步骤(3)得到的糖肽谱图，进行计算机模拟去糖基化处理，根据步骤(2)中的糖基化组合形式，生成去糖基化谱图；(5)对处理后的谱图进行数据库检索，鉴定肽段；(6)对检索到的肽段进行后处理操作，得到最终的鉴定O-糖肽。步骤(2)O-连接糖的组合方法为：根据指定的单条肽段上允许的最大糖基化数目0-50，对所需鉴定的所有O-连接糖，不考虑顺序进行组合，生成肽段上可能存在的糖基化组合的所有形式，以及每种组合的所有糖加和对应的化学组成。步骤(3)中根据谱图中的鎓离子强度进行过滤，如果选定鎓离子的强度大于指定阈值，则认为该谱图为糖肽谱图。步骤(4)计算机模拟去糖基化流程为：对每种糖基化的组合，谱图的母离子价态保持不变，其质量则减去糖组成的质量，生成新的母离子，每个新的母离子对应一张新的谱图，根据新的母离子检测谱图中的Y离子，移除Y离子以简化谱图。步骤(5)数据库检索的蛋白质序列库从UniProt数据库下载而来；检索时不需要设置糖基化可变修饰，设置常规的可变修饰包括脱酰胺(Deamidated)和氧化(Oxidation)，固定修饰脲甲基(Carbamidomethyl)，对谱图的检索结果，保留打分最高的1-10个肽段谱图匹配。步骤(6)中，考虑到复合谱图(一张谱图，由多种肽段碎裂产生)的可能，对原始谱图产生的所有去糖基化谱图的鉴定结果，保留匹配效果最好的1-5个，然后对这些肽段谱图匹配(PSM)进行假阳性率控制，使假阳性率在0.1％-10％。步骤(3)中用于谱图过滤的鎓离子包括：109.02,115.04,126.05,127.04,129.05,138.05,144.07,145.05,147.07,163.06,168.07,186.08,204.09,274.09,292.10,325.11,350.14,366.14,454.16,495.18,512.20,528.19,657.23,690.25；鎓离子匹配的精度为0.001-0.5Da；鎓离子强度阈值采用相对谱图基峰的强度0.0-1.0；检测鎓离子后，可选择将鎓离子从谱图中移除以简化谱图。本专利技术的优点：本专利技术对糖肽谱图进行计算机理论去糖基化处理，在数据库检索时避免了设置糖基化可变修饰，相对传统的数据库检索方法，成指数式的降低了数据库检索的搜索空间，极大地减少了检索时间，降低了谱图随机匹配的概率，实现了O-连接糖基化肽段的高鉴定灵敏度鉴定。附图说明图1是蛋白质糖基化糖肽的数据分析流程的示意图。图2是设置糖基化可变修饰进行数据库的传统方式(T-Search)和本专利技术(O-Search)搜索数据空间的示意图。图3是在相同参数条件下，对三种糖进行鉴定，O-Search和T-Search鉴定到的糖肽谱图数目、糖肽数目以及肽段序列数目的对比。图4是用于分析的人血清中丰度最高的三种O-连接糖(绿色方框)以及额外的其它较为常见的9种O-连接糖。图5是O-Search对3种和12种O-连接糖分别进行鉴定，鉴定到的糖肽谱图、糖肽以及肽段序列数目的对比。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。实施例1首先进行蛋白酶解：将人血清溶解于包含20mMDTT的50mM的HEPS/8Murea缓冲液(pH＝7.4)中变性，在37℃温育2h。然后使用50mM的IAA在黑暗环境下将变性的蛋白质烷基化处理30min。接着加入50mM的HEPS(pH＝7.4)将尿素浓度稀释到1M，以酶比蛋白质量比1:20加入胰蛋白酶酶解蛋白，酶解时间20h，然后使用OasisHLB对酶解后的肽段除盐。然后富集糖肽：将上一步得到的肽段溶解于GlycoBuffer2(pH＝7.5)，加入PNGaseF酶37℃过夜以释放N-连接糖。然后根据文献(Qin,H.etal.An本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种O-连接糖肽的分析方法，其特征在于：/n取蛋白样品，将蛋白酶解，然后用PNGase F酶去除N-糖链，用亲水材料(HILIC tip)富集O-连接糖肽，随后使用LC-MS/MS对这些糖肽进行分析，最后对质谱数据进行O-连接糖肽的高灵敏度鉴定。/n

【技术特征摘要】
1.一种O-连接糖肽的分析方法，其特征在于：
取蛋白样品，将蛋白酶解，然后用PNGaseF酶去除N-糖链，用亲水材料(HILICtip)富集O-连接糖肽，随后使用LC-MS/MS对这些糖肽进行分析，最后对质谱数据进行O-连接糖肽的高灵敏度鉴定。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
质谱数据的分析流程为：
(1)对质谱图进行质心化(centroiding)操作；
(2)对选择的O-连接糖进行排列组合，生成肽段上可能存在的糖基化的所有组合形式；
(3)对质谱图进行过滤，保留糖肽谱图；
(4)对步骤(3)得到的糖肽谱图，进行计算机模拟去糖基化处理，根据步骤(2)中的糖基化组合形式，生成去糖基化谱图；
(5)对处理后的谱图进行数据库检索，鉴定肽段；
(6)对检索到的肽段进行后处理操作，得到最终的鉴定O-糖肽。


3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：
步骤(2)O-连接糖的组合方法为：根据指定的单条肽段上允许的最大糖基化数目，对所需鉴定的所有O-连接糖，不考虑顺序进行组合，生成肽段上可能存在的糖基化组合的所有形式，以及每种组合的所有糖加和对应的化学组成。


4.根据权利要求2所述方法，其特征在于：
步骤(3)中根据谱图中的鎓离子强度进行过滤，如果选定鎓离子的强度大于指定阈值，则认为该谱图为糖肽谱图。


5.根据权利要求2所述方法，其特征在于：
步骤(4)计算机模拟去糖基化流程为：对每种糖基化的组合，谱图的母离子价态保持不变，其质量则减去糖组成的质量，生成新的母离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶明亮，毛家维，由昕，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21