基于硫化改性的CoO制造技术

本发明专利技术属于模拟酶、分析化学技术领域，涉及一种基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶活性比色检测法，包括：分别于5 mL离心管中加入不同活度的碱性磷酸酶和1 mM HMPi，反应30～60 min；再向混合液中依次加入硫化改性的CoOx悬浮液、TMB、H

Coo based on vulcanization modification

【技术实现步骤摘要】
基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶活性比色检测法
本专利技术属于模拟酶、分析化学
，涉及碱性磷酸酶的检测方法，尤其涉及一种基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶活性比色检测法。
技术介绍
碱性磷酸酶(ALP)是一种生物酶，广泛存在于许多人体组织和器官中。它具有催化许多磷酸化物质(例如核酸，蛋白质和小分子)水解的能力。通常，成人血液中ALP的活性范围为40至190U/L。大量研究表明，ALP活性异常与多种疾病密切相关，包括骨损伤，肝功能障碍和前列腺癌。例如，ALP是早期成骨细胞分化过程中成骨细胞活性的重要指标，其活性通常随骨活性的增加而增加。当其活性超过上限时，表示在此过程中可能发生活性骨沉积。另外，其他骨病，例如软骨病，狼疮炎和骨癌，也会导致ALP活性增加。此外，肝胆疾病患者经常发现ALP指标偏高，而严重的慢性肾炎，甲状腺功能低下和贫血会导致ALP活性偏低。因此，它被普遍用作诊断和治疗这些疾病的临床生物标志物。此外，ALP经常用于各种酶联免疫吸附测定(ELISA)中。在这些需求下，开发有效，低成本且易于使用的ALP活性分析方法具有重要意义。目前碱性磷酸酶活性的检测方法主要有荧光法、电化学法、比色法等。例如：中国专利CN110501318A，公开了一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法,将对氨基苯磷酸作为底物,经碱性磷酸酶的催化水解生成对氨基苯酚,对氨基苯酚可以与后续加入的乙二胺发生反应,生成强荧光发射的聚合物碳点。体系中的碱性磷酸酶活性越高,生成的荧光聚合物碳点就越多,荧光就越强,根据检测溶液的荧光强度变化,进行碱性磷酸酶活性的定量检测。中国专利CN110361440A，公开了一种碱性磷酸酶活性便携式电泳滴定检测方法及装置,通过在碱性磷酸酶催化-电泳滴定系统中进行电泳滴定碱性磷酸酶标准品,获得不同活性碱性磷酸酶与对应的界面速度之间的标准曲线；然后在相同条件通过ALP-ET电泳滴定测定未知碱性磷酸酶活性的样品界面速度,通过对比ALP-ET标准曲线获得样品中ALP活性。中国专利CN107422014A，公开了专利技术提供了一种定量检测碱性磷酸酶的方法,通过制备修饰电极,然后利用碱性磷酸酶催化其底物抗坏血酸磷酸酯脱去磷酸根生成具有强还原性的抗坏血酸,而抗坏血酸将反应液中的银离子还原为银单质并沉积电极表面上,最后利用修饰电极表面所沉积银的溶出伏安信号来实现对碱性磷酸酶的高灵敏检测。中国专利CN106596532B，公开了一种简单的碱性磷酸酶活性的检测方法。利用样本溶液中的碱性磷酸酶分析物在催化焦磷酸水解反应后,Cu2+因未被焦磷酸络合而可高效率抑制糖化酶活性,使得水溶性较低的淀粉不被糖化酶水解。反应溶液中的淀粉被滴加到纸微流控分析装置中后使得相应纸体发生从亲水性转变为疏水性的润湿性改变,进而使检测试剂溶液可流过该区域的体积降低,最终导致其在纸装置中的流动长度较短。纸装置中检测试剂溶液的流动长度反比于样本中碱性磷酸酶的活性大小,即完成碱性磷酸酶活性的定量检测。上述已公开的碱性磷酸酶检测方法虽然具有一定的检测效率，但仍具有以下缺点和不足：1)这些检测方法操作相对复杂；2)有些检测方法对环境要求苛刻，成本相对较高，试剂保存条件要求高。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题和不足，本专利技术的目的是提供一种基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶活性比色检测法。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶活性比色检测法，包括如下步骤：1)分别于5mL离心管中加入不同活度的碱性磷酸酶和0.125mL1mMHMPi，反应30～60min，优选50min；所述碱性磷酸酶在体系内的最终活度为0.8U/L、2U/L、4U/L、8U/L、16U/L、32U/L、40U/L、60U/L、120U/L、160U/L、200U/L、240U/L、320U/L；2)再向混合液中依次加入0.05mL1mg/mL的硫化改性的CoOx(Sulfuration-engineeredCoOx)悬浮液、0.1mL5mM的TMB、0.05mL9.8M的H2O2和醋酸盐缓冲液，确定溶液最终总体积为3mL，混匀体系后反应1～30min，优选5min；3)将混合体系过膜后用紫外-可见吸收分光光度计测定TMBox混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652nm处的吸光度；4)将上述TMBox的吸光度测量值与对应的ALP活度绘制校准后的ALP活度-吸光度标准工作曲线；5)将待测ALP样品重复步骤1)～4)，用紫外-可见吸收分光光度计分别测定以TMB为底物时的吸光度，通过计算再与标准工作曲线比对，即可获得ALP活度。本专利技术较优公开例中，步骤2)中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2M。本专利技术较优公开例中，步骤5)中所述待测ALP样品的可检测活度范围为0.8～320U/L，检测限低至0.38U/L。本专利技术所述硫化改性的CoOx，其制备步骤如下：1.将质量比为1:2～4的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与钴盐溶于乙醇，搅拌均匀成溶液A，所述钴盐与乙醇的摩尔比为1:220～260；2.将与钴盐摩尔比为1：4～8的2-甲基咪唑(2-MI)溶于乙醇，搅拌均匀成溶液B，所述钴盐与乙醇的摩尔比为1:220～260；3.将溶液B边搅拌边滴加到等体积的溶液A中，持续搅拌15～45min，静置12～36h；4.以9000～11000r/min的转速离心分离产物，并用乙醇将产物洗涤干净，35～45℃真空干燥，得到棱长为200～250nm的菱形十二面体的紫色固体纳米颗粒；5.将紫色固体纳米颗粒倒入瓷舟置于管式炉中，在氩气保护下以1～10℃/min的速率升至350～750℃，煅烧持续1～4h，冷却至室温，取出后得到黑色固体纳米颗粒；6.将黑色固体纳米颗粒和与之质量比为1：4～8的硫代硫酸钠分别放入两个临近的瓷舟内，置于管式炉中，且装有硫代硫酸钠的瓷舟放在气流上游位置，在氩气气流中进行硫化，程序升温速率为1～10℃/min，400～600℃保持1～3h，冷却至室温，取出即得。进一步的，步骤1所述质量比优选为1:3，钴盐与乙醇摩尔比优选1：250，搅拌时间优选为1h；所述钴盐是硝酸钴、氯化钴、硫酸钴，优选六水合硝酸钴。进一步，步骤2所述钴盐与2-甲基咪唑(2-MI)的摩尔比优选为1:6，钴盐与乙醇摩尔比优选1：250。进一步，步骤3搅拌时间优选为30min，静置时间优选为24h。进一步，步骤4所述转速优选10000r/min，真空干燥优选40℃。进一步，步骤5所述升温速率优选5℃/min，煅烧温度优选500℃，煅烧时间优选2h。进一步，步骤6所述质量比优选为1：6升温速率优选5℃/min，煅烧温度优选500℃，保持时间优选2h。根据本专利技术所公开的方法制得的硫化改性的CoOx纳米颗粒作为类过氧化物酶，含有菱形十二面体结构，所述硫化改性的CoOx纳米颗粒表面棱长为200nm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶比色检测法，其特征在于，包括如下步骤：/n1）分别于5 mL离心管中加入不同活度的碱性磷酸酶和0.125 mL 1 mM HMPi，反应30～60 min；所述碱性磷酸酶在体系内的最终活度为0.8 U/L、2 U/L、4 U/L、8 U/L、16 U/L、32U/L、40 U/L、60 U/L、120 U/L、160 U/L、200 U/L、240 U/L、320 U/L；/n2）再向混合液中依次加入0.05mL 1mg/mL的硫化改性的CoOx悬浮液、0.1 mL 5 mM的TMB、0.05mL 9.8M的H

【技术特征摘要】
1.一种基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶比色检测法，其特征在于，包括如下步骤：
1）分别于5mL离心管中加入不同活度的碱性磷酸酶和0.125mL1mMHMPi，反应30～60min；所述碱性磷酸酶在体系内的最终活度为0.8U/L、2U/L、4U/L、8U/L、16U/L、32U/L、40U/L、60U/L、120U/L、160U/L、200U/L、240U/L、320U/L；
2）再向混合液中依次加入0.05mL1mg/mL的硫化改性的CoOx悬浮液、0.1mL5mM的TMB、0.05mL9.8M的H2O2和醋酸盐缓冲液，确定溶液最终总体积为3mL，混匀体系后反应1～30min；
3）将混合体系过膜后用紫外-可见吸收分光光度计测定TMBox混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652nm处的吸光度；
4）将上述TMBox的吸光度测量值与对应的ALP活度绘制校准后的ALP活度-吸光度标准工作曲线；
5）将待测ALP样品重复步骤1）～4），用紫外-可见吸收分光光度计分别测定以TMB为底物时...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋洪伟，牛湘衡，李欣，薛强胜，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32