一种利用生物法合成乳糖酸的工艺制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种利用生物法合成乳糖酸的工艺，其包括如下步骤：将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，培养得到荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5‑10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，培养24h，然后添加促进培养基，继续发酵培养24‑30h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0‑6.2。本发明专利技术针对菌株转化生成乳糖酸的特点来进行优化发酵条件，缩短了发酵时间，提高了乳糖酸的生产效率。

A process of lactose acid synthesis by biological method

【技术实现步骤摘要】
一种利用生物法合成乳糖酸的工艺
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用生物法合成乳糖酸的工艺。
技术介绍
乳糖酸(Lactobionicacid)是一种多聚羟基酸，属于二糖醛酸家族，这个家族还包括麦芽糖酸和纤维二糖醛酸等；乳糖酸是由一个半乳糖分子和一个葡萄糖酸分子经过醚键相连。乳糖酸的分子量为358.3，极易溶于水。乳糖酸的结构和物理化学性质赋予它许多通用的和潜在的商业应用。乳糖酸可以提供一个极好的平台，用于具有生物适应性和生物所能分解的药物传输工具和生物材料的合成。作为一个关键的生物活性分子，乳糖酸可用于抗衰老和保护皮肤。乳糖酸具有很好的生物相容性、生物降解能力和无毒性。乳糖酸是一个两性分子，可以螯合小分子极性化合物，作为医药中间体，并具有很好的抗氧化性能，已经发现其有许多新的生物活性和具有很好的治疗潜能。因此，最近几年，作为一种生物活性分子乳糖酸受到了越来越多的关注。在这方面，乳糖酸在纳米医学上对肝病的治疗起着重要的作用。乳糖酸作为一个关键的生物分子在纳米技术中也具有非常重要的意义。目前，合成乳糖酸的方法主要包括化学法、酶法以及生物法。市场应用的乳糖酸主要由化学法制得，这是一个高耗能的过程且需要昂贵的金属催化剂。已报道合成乳糖酸的化学方法，如利用化学催化剂溴等催化乳糖合成乳糖酸。化学法所用到的化学试剂是一些有毒的且昂贵的试剂；在反应过程中还会有副产物产生；利用金属催化合成乳糖酸，金属催化剂容易钝化；化学法对pH和温度的稳定的要求相对严格；化学法还容易产生大量的副产物，造成环境污染。酶法合成乳糖酸相对于化学法具产物相对单一、产物易于分离和条件温和等优点，但是用于生物催化的酶需要生产和进一步纯化，而这些步骤成本较高，费时费力。乳糖酸的生物合成法是一种可行的方法，这种方法可以克服化学法和酶法合成乳糖酸的缺陷，绿色环保，而且能耗低，可持续发展性强。尽管微生物发酵合成乳糖酸具有明显的优势，但这一方法研究的却较少。中国专利技术“CN101988046A”公开了一种利用荧光假单胞菌生产乳糖酸的方法，该方法以乳糖为转化底物，添加氮源和无机盐作为发酵培养基，在最优选的条件下，转化率可达到90%，但是该发酵过程时间较长，持续时间为120h，此外还需要添加其他碳源，增加了成本，提高了后续分离纯化的难度。中国专利技术“CN102703542A”和“CN102250986A”分别通过超声波和高压物理场技术对荧光假单胞菌进行刺激，对乳糖酸的转化率有一定的提升作用。文献“乳糖酸产生菌的发酵培养基优化，食品工业科技2014年”以乳糖酸生产菌土生拉乌尔菌为实验菌株，在单因素实验的基础上进行优化培养基和培养条件，提高了发酵液中乳糖酸的浓度。综合现有技术的研究，目前用于生产乳糖酸的菌株主要集中在荧光假单胞菌、腐臭假单胞菌、洋葱假单胞菌、土生拉乌尔菌以及密孔菌等，不同种属的菌株的培养条件差异很大，并不具备参考意义。为了使得微生物催化乳糖生产乳糖酸应用于工业生产中，以满足其日益增长的市场的需求，针对某一特定的产乳糖酸的微生物，我们需要解决以下几个问题：首先，需要尽可能高地提高底物乳糖的浓度，从而提高乳糖酸的产量；其次，通过提高乳糖酸的转化率来提高生产效率；最后，控制培养时间和成本，并且减轻后续分离纯化产品的难度。
技术实现思路
为了克服现有技术生物法转化生成乳糖酸存在的技术缺陷，本专利技术提供了一种利用生物法合成乳糖酸的工艺，该方法通过优化微生物发酵产乳糖酸的培养基和培养条件，能够降低成本，提高生产效率，有利于应用于规模化工业生产。为了实现本专利技术所带来的技术效果，本专利技术采用如下的技术方案。一种利用生物法合成乳糖酸的工艺，其包括如下步骤：将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，培养得到荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，培养24h，然后添加促进培养基，继续发酵培养24-30h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0-6.2。进一步地，所述促进培养基与发酵培养基的比例为：2-3g：1L。进一步地，所述促进培养基的制备方法为：将木质素和氯化钠按照1:50-100的质量比混匀制得。优选地，所述发酵培养的条件为：30℃，通气量为0.4vvm，搅拌速度为100rpm。优选地，所述发酵培养基的组分为：按照重量百分比，15%乳糖、2%玉米浆、1%甘油、0.5%磷酸氢二钾、0.2%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。优选地，所述种子培养基的组分为：按照重量百分比，5%乳糖、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.2%氯化钾、0.1%七水硫酸镁，余量为无菌水。优选地，所述荧光假单胞菌种子液的浓度为108-1010cfu/ml。更优选地，所述荧光假单胞菌种子液的浓度为109cfu/ml。另一方面，本专利技术还要求保护按照上述的方法制备的乳糖酸以及在医药中间体中的应用。本专利技术取得的有益效果主要包括以下几个方面：本专利技术针对菌株转化生成乳糖酸的特点来进行优化发酵条件，缩短了发酵时间，提高了乳糖酸的生产效率。通过流加氨水控制pH为6.0左右，既有利于乳糖酸的转化作用，还能保证适合菌株增殖的酸碱度；维生素B3是多种酶类的重要辅助因子，在发酵培养基中添加适量的VB3有助于提高酶产量。荧光假单胞菌发酵前期以菌株增殖为主，中后期产生相关代谢酶以及合成代谢产物为主，通过将相关糖类氧化酶分泌到胞外，将乳糖转化为乳糖酸；选择在发酵中期添加一定量的氯化钠，能够对菌株产生胁迫，造成酶合成机制的增强，还能够增加渗透压，提高细胞膜的通透性，有利于胞外酶的分泌；低添加量的木质素不会对菌株增殖活力产生负面影响，反而会提高乳糖酸的产量，可能是木质素能够诱导荧光假单胞菌氧化酶的表达，从而进一步提高了乳糖的转化率。在发酵初期添加促进培养基，并不能大幅提高乳糖酸的产量，可能在发酵初期，菌株增殖迅速，胞内的氧化酶未达到饱和水平，分泌到细胞外的相对较少。附图说明图1：氯化钠对乳糖酸转化率的影响；图2：氯化钠对乳糖酸生产速率的影响；图3：木质素对乳糖酸转化率的影响；图4：木质素对乳糖酸生产速率的影响。具体实施方式本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1一种利用生物法合成乳糖酸的工艺，其包括如下步骤：将荧光假单胞菌ATCC17400为试验菌株，活化，然后接种到种子培养基上进行培养，30℃，通气量为0.3vvm，培养至浓度为109cf本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用生物法合成乳糖酸的工艺，其包括如下步骤：/n将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，培养得到荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，培养24h，然后添加促进培养基，继续发酵培养24-30h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0-6.2。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用生物法合成乳糖酸的工艺，其包括如下步骤：
将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，培养得到荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，培养24h，然后添加促进培养基，继续发酵培养24-30h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0-6.2。


2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述促进培养基与发酵培养基的比例为：2-3g：1L。


3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述促进培养基的制备方法为：将木质素和氯化钠按照1:50-100的质量比混匀制得。


4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养的条件为：30℃，通气量为0.4vvm，搅拌速度为100rpm。


...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘加林，霍萧勇，刘加海，方朝杰，张渊源，
申请(专利权)人：杭州巴洛特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33