提高微生物转化生成乳糖酸的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）一次发酵：将荧光假单胞菌种子液接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养20‑24h，然后添加促进培养基；继续发酵24‑36h，停止发酵，得到发酵液；步骤2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加二次发酵培养基，继续发酵培养10‑14h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于后续分离提取乳糖酸。本发明专利技术对废弃的湿菌体进行了二次利用，变废为宝，提高了乳糖酸的产率。

Methods of improving microbial transformation to produce lactose acid

【技术实现步骤摘要】
提高微生物转化生成乳糖酸的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及提高微生物转化生成乳糖酸的方法。
技术介绍
乳糖酸是一种重要的药物中间体，广泛已应用于医药制备
目前，合成乳糖酸的方法主要包括化学法、酶法以及生物法。市场应用的乳糖酸主要由化学法制得，高耗能且需要昂贵的金属催化剂。化学法所用到的化学试剂是一些有毒的且昂贵的试剂；在反应过程中还会有副产物产生；利用金属催化合成乳糖酸，金属催化剂容易钝化；化学法对pH和温度的稳定的要求相对严格，还容易产生大量的副产物，造成环境污染。酶法合成乳糖酸相对于化学法具产物相对单一、产物易于分离和条件温和等优点，但是用于生物催化的酶需要生产和进一步纯化，而这些步骤成本较高，费时费力。乳糖酸的生物合成法是一种可行的方法，这种方法可以克服化学法和酶法合成乳糖酸的缺陷，绿色环保，而且能耗低，可持续发展性强。中国专利技术“CN101988046A”公开了一种利用荧光假单胞菌生产乳糖酸的方法，该方法以乳糖为转化底物，添加氮源和无机盐作为发酵培养基，在最优选的条件下，转化率可达到90%，但是该发酵过程时间较长，持续时间为120h，此外还需要添加其他碳源，增加了成本，提高了后续分离纯化的难度。中国专利技术“CN102703542A”和“CN102250986A”分别通过超声波和高压物理场技术对荧光假单胞菌进行刺激，对乳糖酸的转化率有一定的提升作用。文献“乳糖酸产生菌的发酵培养基优化，食品工业科技2014年”以乳糖酸生产菌土生拉乌尔菌为实验菌株，在单因素实验的基础上进行优化培养基和培养条件，使得发酵液中乳糖酸的浓度和转化率大幅提高。目前，生物转化合成乳糖酸的研究大多处于实验室阶段，为了使得微生物催化乳糖生产乳糖酸应用于工业生产中，以满足其日益增长的市场的需求，针对某一特定的产乳糖酸的微生物，我们需要解决以下几个问题：首先，需要尽可能高地提高底物乳糖的浓度，从而提高乳糖酸的产量；其次，通过提高乳糖酸的转化率来提高生产效率；最后，控制培养时间和成本，并且减轻后续分离纯化产品的难度。据此，申请人之前的专利技术“一种利用生物法合成乳糖酸的工艺”对荧光假单胞菌发酵培养条件进行了优化，通过添加促进培养基，提高了乳糖酸的生产速率和转化率。
技术实现思路
本专利技术旨在上述专利技术的基础上，继续对发酵条件进行优化，以进一步提高乳糖酸的产量。本专利技术是通过如下技术方案来实现的。提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1）一次发酵：将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，培养得到荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养20-24h，然后添加促进培养基；继续发酵24-36h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0-6.2；步骤2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加二次发酵培养基，继续发酵培养10-14h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于后续分离提取乳糖酸。优选地，所述促进培养基的制备方法为：将木质素和氯化钠按照1:50-100的质量比混匀制得。优选地，所述种子培养基为：按照重量百分比，5%乳糖、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.2%氯化钾、0.1%七水硫酸镁，余量为无菌水。优选地，所述发酵培养基为：按照重量百分比，15%乳糖、2%玉米浆、1%甘油、0.5%磷酸氢二钾、0.2%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。优选地，所述促进培养基与发酵培养基的比例为：2-3g：1L。优选地，所述二次发酵培养基为：按照重量百分比，10%乳糖、0.5%玉米浆、0.3%磷酸氢二钾、0.1%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。优选地，所述陶瓷膜的截留分子量为1万Da。优选地，所述二次发酵培养基和湿菌体的体积比为3-5:1。更优选地，所述促进培养基与发酵培养基的比例为：3g：1L。更优选地，所述二次发酵培养基和湿菌体的体积比为4:1。本专利技术取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：本专利技术采用两次菌体培养方式，提高了发酵效率，实现了变废为宝。第一次培养：针对菌株转化生成乳糖酸的特点来进行优化发酵条件，缩短了发酵时间，提高了乳糖酸的生产效率。通过流加氨水控制pH为6.0左右，既有利于乳糖酸的转化作用，还能保证适合菌株增殖的酸碱度；维生素B3是多种酶类的重要辅助因子，添加适量的VB3有助于提高酶产量。荧光假单胞菌发酵前期以菌株增殖为主，中后期产生相关代谢酶以及合成代谢产物为主，通过将相关糖类氧化酶分泌到胞外，将乳糖转化为乳糖酸；选择在发酵中期添加一定量的氯化钠，能够对菌株产生胁迫，造成酶合成机制的增强，还能够增加渗透压，提高细胞膜的通透性，有利于胞外酶的分泌；低添加量的木质素不会对菌株增殖活力产生负面影响，反而会提高乳糖酸的产量，可能是木质素能够诱导荧光假单胞菌氧化酶的表达，从而进一步提高了乳糖的转化率。第二次培养为：针对第一次发酵完成的发酵液进行过滤处理，以分离发酵清液用于后续提取乳糖酸，解除了乳糖酸的反馈抑制后，湿菌体仍然具备产酶和转化乳糖生成乳糖酸的能力；申请人继续往湿菌体中添加乳糖培养液，持续培养一段时间后，能产生一定量的乳糖酸；上述操作方式对废弃的湿菌体进行了二次利用，变废为宝，提高了工业附加值。附图说明图1：氯化钠对乳糖酸转化率的影响；图2：氯化钠对乳糖酸生产速率的影响；图3：木质素对乳糖酸转化率的影响；图4：木质素对乳糖酸生产速率的影响；图5：二次发酵时间和培养基对乳糖酸产量的影响。具体实施方式本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其包括如下步骤：1）一次发酵：将荧光假单胞菌ATCC17400为试验菌株，活化，然后接种到种子培养基上进行培养，30℃，通气量为0.3vvm，培养至浓度为109cfu/ml的荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，30℃，通气量为0.4vvm，以100rpm的搅拌速度培养24h，然后添加促进培养基，促进培养基与发酵培养基的比例为：3g：1L；继续发酵30h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0。...

【技术保护点】
1.提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n步骤1）一次发酵：将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，得到荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养20-24h，然后添加促进培养基；继续发酵24-36h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0-6.2；/n步骤2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加二次发酵培养基，继续发酵培养10-14h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于分离提取乳糖酸。/n

【技术特征摘要】
1.提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）一次发酵：将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，得到荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养20-24h，然后添加促进培养基；继续发酵24-36h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0-6.2；
步骤2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加二次发酵培养基，继续发酵培养10-14h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于分离提取乳糖酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述促进培养基的制备方法为：将木质素和氯化钠按照1:50-100的质量比混匀制得。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为：按照重量百分比，5%乳糖、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.2%氯化钾、0.1%七水硫酸镁，余量为无菌水。


4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘加林，霍萧勇，刘加海，方朝杰，张渊源，
申请(专利权)人：杭州巴洛特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33