重组PRRS病毒HV-NSP2（658-777）和HV-NSP2（56）及其应用制造技术

本发明专利技术公开了重组PRRS病毒HV‑NSP2(658‑777)和HV‑NSP2(56)及其应用。本发明专利技术的重组PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列为将野生型PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列自5’末端第3220‑3579位所示的DNA分子缺失后所获得的序列或将野生型PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列自5’末端第2833‑3036位所示的DNA分子缺失，且将第3220‑3579位所示的DNA分子缺失后所获得的序列。本发明专利技术揭示了高致病性PRRSV引起高热的分子机制，同时本发明专利技术重组PRRS病毒相较于高致病性PRRSV而言毒力降低，复制能力也大大减缓，为研发新型弱毒疫苗提供了基础。

Recombinant PRRS virus hv-nsp2 (658-777) and hv-nsp2 (56) and their application

【技术实现步骤摘要】
重组PRRS病毒HV-NSP2(658-777)和HV-NSP2(56)及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及重组PRRS病毒HV-NSP2(658-777)和HV-NSP2(56)及其应用。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyn—drome，简称PRRS)，俗称蓝耳病，是目前危害全世界养猪业的重要病毒性疫病之一。引起猪繁殖与呼吸综合征的病因是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruse，PRRSV)。猪繁殖与呼吸综合征病毒是一种单链正义的RNA病毒，属于尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。该病毒包括欧洲型(Ⅰ型)和美洲型(Ⅱ型)两种亚型，目前欧洲型主要分布在欧洲，而美洲型分布在北美，南美以及亚洲等地区。1995年，我国北部首次报道了猪繁殖与呼吸综合征的爆发，随后蔓延至全国各地。通常情况下，经典的PRRSV毒株在临床上主要引起妊娠母猪繁殖障碍(如流产、死胎、木乃伊胎及弱胎)和仔猪呼吸障碍。由于病毒本身突变速度很快，导致除欧洲型和美洲型的原型外，衍生出很多不同毒力的毒株。2006年，在我国爆发了由PRRS病毒变异株(高致病性PRRSV病毒)引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(又称无名高热)。与经典的猪繁殖与呼吸综合征相比，感染高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的病猪以持续高热为主要特征，体温达40-42度，而且发病猪不分年龄段均会出现高死亡率的急性死亡，被感染的仔猪发病率可达100％。死亡率高达50％-100％，母猪流产率可达100％，而且母猪和育肥猪死亡率高达30％或更高。研究表明，猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的高热与死亡率成正比，即温度越高，死亡速度越快。猪繁殖与呼吸综合征疾病严重程度与PRRSV毒力相关。感染高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病猪在感染后第二天即出现高热现象，且一直持续。而感染传统猪繁殖与呼吸综合征病毒的病猪体温变化不明显，也未达到高热的现象。因此，从引起高热机制中，寻找致弱高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法可能是一个出发点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何致弱高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种重组PRRS病毒。本专利技术提供的重组PRRS病毒为如下(1)或(2)：(1)所述重组PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列为将野生型PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列自5’末端第3220-3579位所示的DNA分子缺失后所获得的序列；(2)所述重组PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列为将野生型PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列自5’末端第2833-3036位所示的DNA分子缺失，且将第3220-3579位所示的DNA分子缺失后所获得的序列。上述重组PRRS病毒中，所述野生型PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列如序列表中的序列1所示。为了解决上述技术问题，本专利技术又提供了上述重组PRRS病毒的新用途。本专利技术提供了上述重组PRRS病毒在制备PRRS疫苗中的应用。本专利技术还提供了上述重组PRRS病毒在制备PRRS弱毒疫苗中的应用。本专利技术还提供了上述重组PRRS病毒在制备预防猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种DNA片段。本专利技术提供的DNA片段为如下1)或2)：1)是将序列表序列1自5’末端第3220-3579位所示的DNA分子缺失后得到的DNA片段；2)是将序列表序列1自5’末端第2833-3036位所示的DNA分子缺失，且将第3220-3579位所示的DNA分子缺失后得到的DNA片段。上述DNA片段在制备上述重组PRRS病毒和/或制备PRRS疫苗和/或制备PRRS弱毒疫苗中的应用也属于本专利技术的保护范围。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了含有上述DNA片段的重组质粒、重组菌或重组细胞。所述重组质粒为将质粒pcDNA3.1-HV中对应于序列表序列1自5’末端第3220-3579位所示的DNA分子缺失后得到的序列或将质粒pcDNA3.1-HV中对应于序列表序列1自5’末端第2833-3036位所示的DNA分子缺失，且将第3220-3579位所示的DNA分子缺失后得到的序列。进一步的，所述pcDNA3.1-HV载体为将pcDNA3.1载体的SmiI和NotI酶切位点间的小片段替换为序列表中的序列1所示的HV毒株的基因组全长cDNA序列后得到的载体。所述重组细胞为含有所述重组质粒的HEK-293T细胞。上述重组质粒、重组菌或重组细胞在制备上述重组PRRS病毒和/或制备PRRS疫苗和/或制备PRRS弱毒疫苗中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术为了致弱高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HV的非结构蛋白2(NSP2)中第500-596位和/或第658-777位所示的氨基酸区域为目标区段进行改造，构建得到重组PRRS病毒。相较于高致病性PRRSV而言，本专利技术的重组PRRS病毒毒力降低，复制能力也大大减缓，为研发新型弱毒疫苗提供了基础。附图说明图1为间接免疫荧光检测成功拯救出的病毒。图2为在感染后指定的时间收集上清，用TCID50的方法检测病毒滴度。图3为感染后96小时病毒诱导的细胞病变。图4为感染后直肠温度变化。图5为感染后存活率比较。图6为感染后体重变化。图7为感染后血清中病毒滴度变化。图8为感染后组织中病毒RNA含量。图9为感染后组织H&E染色结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中所用的野生型PRRSV高致病毒株HV：Genbank号为JX317648.1，公众可从中国农业大学获得。下述实施例的数据分析方法：所有数据都是独立重复三次得到的平均值，用双尾T-test(成对)分析差异显著性，P≤0.05被认为差异显著，0.01<P≤0.05(*)，0.005<P≤0.01(**)，P≤0.005(***)。实施例1、重组PRRS病毒HV-NSP2(500-596)、HV-NSP2(658-777)、HV-NSP2(56)的获得一、目标区段的选择通过对PRRS病毒引起高热的分子机制研究发现，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV，简称HV)的非结构蛋白2(NSP2)中相对于经典型PRRSV毒株VR2332的NSP2中第500-596位和第658-777位这两段氨基酸区域是高致病性猪繁殖与呼本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组PRRS病毒，为如下(1)或(2)：/n(1)所述重组PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列为将野生型PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列自5’末端第3220-3579位所示的DNA分子缺失后所获得的序列；/n(2)所述重组PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列为将野生型PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列自5’末端第2833-3036位所示的DNA分子缺失，且将第3220-3579位所示的DNA分子缺失后所获得的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组PRRS病毒，为如下(1)或(2)：
(1)所述重组PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列为将野生型PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列自5’末端第3220-3579位所示的DNA分子缺失后所获得的序列；
(2)所述重组PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列为将野生型PRRS病毒的基因组对应的cDNA序列自5’末端第2833-3036位所示的DNA分子缺失，且将第3220-3579位所示的DNA分子缺失后所获得的序列。


2.权利要求1所述的重组PRRS病毒在制备PRRS疫苗中的应用；
或，权利要求1所述的重组PRRS病毒在制备PRRS弱毒疫苗中的应用。


3.权利要求1所述的重组PRRS病毒在制备预防猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。


4.DNA片段，为如下1)或2)：
1)是将序列表序列1自5’末端第3220-3579位所示的DNA分子缺失后得到的DNA片段；
2)是将序列表序列1自5’末端第2833-3036位所示的DNA分子缺失，且将第3220-3579位所示的DNA分子缺失后得到的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：封文海，杜丽，唐军，王红蕾，刘芳，魏泽宇，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11