一种重组兔单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组兔单克隆抗体的制备方法，利用免疫提升的兔B细胞进行分离、噬菌体展示等技术，通过特异性引物扩增出抗体基因片段，构建抗体库，使用抗原进行淘选，获得阳性克隆，测序鉴定，获得重链与轻链序列，进行体外重组表达，并测定抗体，本发明专利技术制备的单克隆抗体与传统方法制备单克隆抗体的制备相比，单克隆抗体制备效率更高，操作更便捷，实验兔的免疫系统筛选到的可以识别特定抗原的单克隆抗体，与小鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有亲和力高、识别的抗原表位更丰富和能识别在小鼠体内没有免疫原性抗原的突出特点。

A preparation method of recombinant rabbit monoclonal antibody

【技术实现步骤摘要】
一种重组兔单克隆抗体的制备方法
本专利技术属于单克隆抗体制备领域，具体涉及一种重组兔单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
抗体是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，它是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，抗体在疾病的诊断、免疫防治及基础研究中发挥作重要作用，抗体分为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体在医药治疗上有广泛的前景，被用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病；中国专利技术专利CN1763217A公开了一种单克隆抗体的制备方法及其应用，该专利技术用杀菌后的金色葡萄球菌免疫BALB/c小鼠，再提取免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗金色葡萄菌单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需单克隆抗体，该专利技术通过杂交瘤细胞进一步进行获得单克隆抗体的制备效率较低高，产量不高，同时通过小鼠免疫系筛选的单克隆抗体单抗亲和力整体较低，识别的抗原表位较为单一，不能识别没有免疫原性的抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组兔单克隆抗体的制备方法，利用免疫提升的兔B细胞进行分离、噬菌体展示等技术，通过特异性引物扩增出抗体基因片段，构建抗体库，使用抗原进行淘选，获得阳性克隆，测序鉴定，获得重链与轻链序列，进行体外重组表达，并测定抗体，本专利技术制备的单克隆抗体与传统方法制备单克隆抗体的制备相比单克隆抗体制备效率更高，操作便捷，同时用实验兔的免疫系统筛选到的可以识别特定抗原的单克隆抗体，与小鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有亲和力高、识别的抗原表位更丰富和能识别在小鼠体内没有免疫原性的抗原。本专利技术要解决的技术问题：1、传统制备单克隆抗体，大多采用小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞，进行融合培养杂交瘤细胞，进一步获得单克隆抗体，但得到的单克隆抗体的单抗亲和力整体较低，识别的抗原表位较为单一，不能识别没有免疫原性的抗原。2、传统制备单克隆抗体的方法为通过免疫增强的小鼠的B细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合得到杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行抗体检测后，进行克隆化，得到阳性杂交瘤细胞，将阳性杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中，培养一周提取腹水中的单克隆抗体，该方法获得的单克隆抗体有被动物病毒污染的可能，同时单克隆抗体制备效率低，操作复杂。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种重组兔单克隆抗体的制备方法，包括以下方法：(1)、将兔背部部分毛发剪下，用酒精擦拭兔的背部，将重组蛋白和弗氏完全佐剂加入烧杯中，搅拌至充分乳化，注射至兔背部皮下进行培养，得到免疫增强的兔；(2)、提取步骤(1)获得的免疫增强的兔的B细胞，通过兔的B细胞进一步获得混合抗体基因片段；(3)、将步骤(2)获得的混合抗体基因片段进行扩增，通过扩增后的混合抗体基因片段建立噬菌体抗体文库，进一步对噬菌体文库进行包装；(4)、将目的抗原包被于固相表面加入步骤(3)形成的噬菌体抗体文库，得到目的抗体，进行检测获得抗体序列；(5)、步骤(4)得到的抗体序列进行分析，构建表达载体并进行鉴定。进一步，步骤(1)所述的兔为3公斤健康新西兰大自兔，所述的重组蛋白的浓度为1mg/ml；所述的免疫增强的兔的培养过程如下：将1mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第一混合溶液，将第一混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天后，将0.5mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第二混合溶液，将第二混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天，得到免疫增强的兔。进一步，步骤(2)所述的兔B细胞提取过程如下：对免疫增强的兔进行耳缘静脉采血10ml，使用兔淋巴细胞分离液进行处理，获得兔外周血PBMC，使用磁珠偶联真核表达的兔CD19蛋白，得到高纯度的兔B细胞；所述的混合抗体基因片段的制取方法如下：通过Trizol法提取兔B细胞RNA，并进行逆转录实验，获得cDNA，使用特异性引物进行PCR，获得混合抗体基因片段。进一步，步骤(3)所述的噬菌体文库建立方法如下：用特异性引物分别扩增混合抗体基因片段抗体VH和VL，过胶回收330bp的片段，使用OverlappingPCR连接成ScFv，然后经Sfi1酶切后，连接pComb3xss载体，连接产物纯化以后电转XL1-Blue感受态细胞，形成噬菌体抗体文库；所述的包装方法如下：将抗体文库菌扩增至OD600＝0.5，然后加入野生型辅助噬菌体，感染宿主菌，过夜扩增宿主菌，用PEG-NaCl沉淀细菌得到上清液，即可得到抗体文库。进一步，步骤(4)所述的抗体序列的测定方法如下：将目的抗原包被于固相表面加入抗体文库，用PH＝2.2盐酸洗脱结合的噬菌体，再将噬菌体感染宿主细菌，重复上述步骤三次得到目的抗体，挑取再感染后的单个细菌进行克隆，扩增培养以后加入辅助噬菌体，用Phage-ELISA鉴定与目的抗原结合的特异性，将Phage-ELISA阳性的抗体进行测序，获得抗体序列。进一步，步骤(5)所述的分析具体为：抗体序列通过IMGT数据库进行分析，用NCBI中Ig-Blast分析抗体序列信息，比较个抗体差异及同源性分析。进一步，步骤(5)所述的构建表达载体具体为：将抗体片段还原成IgG形式的全抗体，并使用EXPI293系统进行表达。进一步，步骤(5)所述的鉴定分别为：1)单克隆抗体与抗原结合的特异性鉴定，通过ELISA,WB以及IFA进行鉴定；2)单克隆抗体生物学活性鉴定，为抗体的阻断，中和以及对目的抗原的功能的限制；3)单克隆抗体亲和力鉴定，是抗体结合抗原的动力学参数。本专利技术的有益效果：本专利技术通过利用实验兔的免疫系统筛选到的可以识别特定抗原的单克隆抗体，与传统的利用实验小鼠的免疫系统筛选到的可以识别特定抗原的单克隆抗体相比，具有更高的亲和力，识别的抗原表位丰富，可以识别小鼠体内没有免疫原性抗原，同时与传统制备单克隆抗体的方法不同，传统制备单克隆抗体的方法，先对小鼠进行免疫培养，提取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞，通过细胞融合制得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞克隆化得到阳性杂交瘤细胞，选用BALB/c小鼠用降植烷进行小鼠腹腔注射，一周后将阳性杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠腹水，提取腹水中的单克隆抗体，而本专利技术利用免疫提升的兔B细胞进行分离、噬菌体展示等技术，通过特异性引物扩增出抗体基因片段，构建抗体库，使用抗原进行淘选，获得阳性克隆，测序鉴定，获得重链与轻链序列，进行体外重组表达，并测定抗体，本专利技术制备的单克隆抗体与传统方法制备单克隆抗体的制备相比单克隆抗体制备效率更高，操作更便捷，不会被动物体内的病毒污染。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1...

【技术保护点】
1.一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)、将兔背部部分毛发剪下，用酒精擦拭兔的背部，将重组蛋白和弗氏完全佐剂加入烧杯中，搅拌至充分乳化，注射至兔背部皮下进行培养，得到免疫增强的兔；/n(2)、提取步骤(1)获得的免疫增强的兔的B细胞，通过兔的B细胞进一步获得混合抗体基因片段；/n(3)、将步骤(2)获得的混合抗体基因片段进行扩增，通过扩增后的混合抗体基因片段建立噬菌体抗体文库，进一步对噬菌体文库进行包装；/n(4)、将目的抗原包被于固相表面加入步骤(3)形成的噬菌体抗体文库，得到目的抗体，进行检测获得抗体序列；/n(5)、步骤(4)得到的抗体序列进行分析，构建表达载体并进行鉴定。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、将兔背部部分毛发剪下，用酒精擦拭兔的背部，将重组蛋白和弗氏完全佐剂加入烧杯中，搅拌至充分乳化，注射至兔背部皮下进行培养，得到免疫增强的兔；
(2)、提取步骤(1)获得的免疫增强的兔的B细胞，通过兔的B细胞进一步获得混合抗体基因片段；
(3)、将步骤(2)获得的混合抗体基因片段进行扩增，通过扩增后的混合抗体基因片段建立噬菌体抗体文库，进一步对噬菌体文库进行包装；
(4)、将目的抗原包被于固相表面加入步骤(3)形成的噬菌体抗体文库，得到目的抗体，进行检测获得抗体序列；
(5)、步骤(4)得到的抗体序列进行分析，构建表达载体并进行鉴定。


2.根据权利要求1所述的一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的兔为3公斤健康新西兰大自兔，所述的重组蛋白的浓度为1mg/ml；所述的免疫增强的兔的培养过程如下：将1mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第一混合溶液，将第一混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天后，将0.5mg重组蛋白和等体积的弗氏完全佐剂加入烧杯中，进行搅拌至充分乳化，制得第二混合溶液，将第二混合溶液注射至兔背部皮下，进行免疫增强21天，得到免疫增强的兔。


3.根据权利要求1所述的一种重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的兔B细胞提取过程如下：对免疫增强的兔进行耳缘静脉采血10ml，使用兔淋巴细胞分离液进行处理，获得兔外周血PBMC，使用磁珠偶联真核表达的兔CD19蛋白，得到高纯度的兔B细胞；所述的混合抗体基因片段的制取方法如下：通过Trizol法提取兔B细胞RNA，并进行逆转录实验，获得cDNA，使用特异性引物进行PCR，获得混合抗体基因片段。


4.根据权利要求1所述的一种重组兔单克隆抗体的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，缪连军，张磊，
申请(专利权)人：安徽环球基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34