一种集成式外泌体检测芯片制造技术

本发明专利技术提供了一种集成式外泌体检测芯片，外泌体分离与检测领域。所述微流控芯片分五个单元，进样单元，外泌体富集单元，一抗孵育单元，辣根过氧化酶标记单元及显色检测单元。所述外泌体富集单元位于进样单元后方，所述一抗孵育单元位于外泌体富集单元后方，所述辣根过氧化酶标记单元位于一抗孵育单元后方，所述显色检测单元位于辣根过氧化酶标记单元后方。本发明专利技术通过将样品引入，外泌体富集，非外泌体物质清洗，染色检测集中在一块芯片上，优化了外泌体检测步骤，极大地提高了外泌体的检测效率，并且简化了人工操作的程序，取得了较好的外泌体检测效果。

【技术实现步骤摘要】
一种集成式外泌体检测芯片
本专利技术属外泌体分离与检测领域，尤其涉及一种集成式外泌体检测芯片。
技术介绍
外泌体是细胞分泌的含有脂质、蛋白、mRNAs等多种物质的纳米级囊泡，其在人体内分布广泛，人体的体液如尿液、血液、乳汁、唾液等大都都含有外泌体。外泌体在人体内主要有物质传递及信息传导两大作用。研究表明，外泌体在炎症过程、适应性免疫、胚胎形成、肿瘤的发生与发展过程中均发挥了重要的作用。但如何有效的将外泌体从体液中分离出来仍然是一个很大的挑战，目前常用的超速离心、超滤等分离方式费时费力并且产物的纯度难以保证。微流控芯片技术(Microfluidics)是一项把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程的技术。自20世纪90年代初由A.Manz提出微流控芯片的概念以来，微流控技术迎来了突飞猛进的发展，2001年LabonaChip创刊，2004年Business2.0将其誉为“改变未来的七种技术之一”，2006年7月Nature杂志推出了“芯片实验室”专辑。目前，微流控芯片技术因其在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。因其具有微型化、集成化等优点，微流控芯片技术在外泌体分离领域也占有了一席之地。但想要高效的获得高纯度外泌体并对其进行检测分析仍是一个难题，需要进一步的探索。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种集成式外泌体检测芯片。一种集成式外泌体检测芯片，该微流控芯片主要由上层通道层、中层无结构层以及底层磁铁层组成；上层通道层由四个入口、三个反应池、三个S型混合通道以及直通道组成，四个入口分别是进样入口、缓冲液入口、一抗入口以及辣根过氧化酶标记的二抗入口；三个S型混合通道分别为样品混合通道、一抗与样品混合通道、二抗与样品混合通道；三个反应池分别为清洗池、一抗孵育池和二抗孵育与显色池；底层磁铁层主要由三个圆柱型的磁铁坑构成，每个坑里面有一个直径2mm，高2mm的圆柱形小磁铁，其中三个圆柱型的磁铁坑位置和三个反应池位置一一对应；进样入口和样品缓冲液入口呈Y形相交与样品混合通道连接，样品混合通道下连清洗池；一抗入口通过通道分别从两边包围进样入口和样品缓冲液入口并以十字形与一抗与样品混合通道连接，一抗与样品混合通道上连清洗池，下连一抗孵育池；二抗入口通过通道分别从两边包围二抗孵育与显色池并以十字形与二抗与样品混合通道连接，二抗与样品混合通道上连一抗孵育池，下连二抗孵育与显色池。所述顶层通道层通道高度为100μm-1mm，三个反应池直径为3mm-8mm，其中二抗孵育与显色池向上打通，其它通道宽度为250μm-1mm。所述微流控芯片按照以下步骤进行制备：使用autoCAD软件画出掩膜，使用SU8胶制备上层通道层模板，使用混合好的PDMS(PDMS：引发剂＝5:1-20:1)进行倒模，使用氧等离子设备将上层通道层和中层无结构层封接；取一厚度大于2mm的空白PDMS，对照反应池的位置打直径为2mm的圆孔，将小磁铁置于圆孔中；最后将封接好的上层通道和中间无结构层芯片置于空白PDMS上，磁铁和反应池位置对齐。一种集成式外泌体检测芯片的应用。所述微流控芯片使用前需要进行疏水修饰，方法为将芯片置于真空干燥机中抽真空至少15min，接着向所有通道中加入含2％-5％十八烷基三氯硅烷的十六烷，室温孵育3-6分钟；吸干通道中液体，先后使用乙醇和水清洗通道至少5min，将芯片置于80℃烘箱1h以上，备用。所述微流控芯片使用时需用免疫磁珠捕获外泌体后再进行分离与检测，所用链酶亲和素免疫磁珠捕获前需进行修饰，其修饰步骤为：使用2μg/ml-10μg/ml的生物素化的EpCAM与免疫磁珠混合，4℃过夜孵育，取出后用PBS清洗三次以上，之后将其和待检测样品混合4℃孵育一小时以上，备用。所述微流控芯片使用时所有通道内流速为1μL/min-10μL/min。本专利技术的优点：1、本专利技术将样品引入，外泌体富集，非外泌体物质清洗，染色检测集中在一块芯片上，优化了外泌体检测流程。2、本专利技术通过磁铁对磁珠进行吸附，简化了人工操作，减少误差，实现了传统方法很难实现的时空分辨率。3、本专利技术最终可借助TMB显色反应进行观测，肉眼便可以见到实验结果无需借助其他设备，方便快捷。附图说明图1是集成式外泌体检测芯片掩膜示意图；图2是集成式外泌体检测芯片3D示意图；其中：1.一抗入口2.样品入口3.缓冲液入口4.样品混合通道5.样品与一抗混合通道6.样品与二抗混合通道7.辣根过氧化酶标记的二抗入口8.清洗池9.一抗孵育池10.二抗孵育与显色池11.小磁铁A.外泌体捕获单元B.一抗孵育单元C.二抗孵育单元D.显色单元。图3是集成式外泌体检测芯片检测原理图；图4是集成式外泌体检测芯片不同流速下磁铁对磁珠的捕获率；图5是集成式外泌体检测芯片捕获了磁珠后不同流速下捕获的磁珠的逃逸率。具体实施方式下面将通过具体实施例对本专利技术做进一步说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1一种集成式外泌体检测芯片的制备使用autoCAD软件画出如图1所示掩膜图形，使用SU8胶制备上层通道层模板，使用混合好的PDMS(PDMS：引发剂＝10:1)进行倒模，使用氧等离子设备将上层通道层和中层无结构层封接；取一厚度为2mm的空白PDMS，对照反应池的位置打直径为2mm的圆孔，将小磁铁置于圆孔中；最后将封接好的上层通道和中间无结构层芯片置于空白PDMS上，磁铁和反应池位置对齐，备用。该微流控芯片如图1、图2所示主要由上层通道层、中层无结构层以及底层磁铁层组成；上层通道层由四个入口、三个反应池、三个S型混合通道以及直通道组成，四个入口分别是进样入口2、缓冲液入口3、一抗入口1以及辣根过氧化酶标记的二抗入口7；三个S型混合通道分别为样品混合通道4、一抗与样品混合通道5、二抗与样品混合通道6；三个反应池分别为清洗池8、一抗孵育池9和二抗孵育与显色池10；底层磁铁层主要由三个圆柱型的磁铁坑构成，每个坑里面有一个直径2mm，高2mm的圆柱形小磁铁，其中三个圆柱型的磁铁坑位置和三个反应池位置一一对应；进样入口2和样品缓冲液入口3呈Y形相交与样品混合通道4连接，样品混合通道4下连清洗池8；一抗入口1通过通道分别从两边包围进样入口2和样品缓冲液入口3并以十字形与一抗与样品混合通道5连接，一抗与样品混合通道5上连清洗池8，下连一抗孵育池9；二抗入口7通过通道分别从两边包围二抗孵育与显色池10并以十字形与二抗与样品混合通道6连接，二抗与样品混合通道6上连一抗孵育池9，下连二抗孵育与显色池10。顶层通道层通道高度为250μm，三个反应池直径为5mm，其中二抗孵育与显色池向上打通，其它通道宽度为300μm。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种集成式外泌体检测芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由上层通道层、中层无结构层以及底层磁铁层组成；/n所述上层通道层由四个入口、三个反应池、三个S型混合通道以及直通道组成，四个入口分别是进样入口、缓冲液入口、一抗入口以及辣根过氧化酶标记的二抗入口；三个S型混合通道分别为样品混合通道、一抗与样品混合通道、二抗与样品混合通道；三个反应池分别为清洗池、一抗孵育池和二抗孵育与显色池；/n所述底层磁铁层主要由三个圆柱型的磁铁坑构成，每个坑里面有一个直径2mm，高2mm的圆柱形小磁铁，/n其中三个圆柱型的磁铁坑位置和三个反应池位置一一对应；进样入口和样品缓冲液入口呈Y形相交与样品混合通道连接，样品混合通道下连清洗池；一抗入口通过通道分别从两边包围进样入口和样品缓冲液入口并以十字形与一抗与样品混合通道连接，一抗与样品混合通道上连清洗池，下连一抗孵育池；二抗入口通过通道分别从两边包围二抗孵育与显色池并以十字形与二抗与样品混合通道连接，二抗与样品混合通道上连一抗孵育池，下连二抗孵育与显色池。/n

【技术特征摘要】
1.一种集成式外泌体检测芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由上层通道层、中层无结构层以及底层磁铁层组成；
所述上层通道层由四个入口、三个反应池、三个S型混合通道以及直通道组成，四个入口分别是进样入口、缓冲液入口、一抗入口以及辣根过氧化酶标记的二抗入口；三个S型混合通道分别为样品混合通道、一抗与样品混合通道、二抗与样品混合通道；三个反应池分别为清洗池、一抗孵育池和二抗孵育与显色池；
所述底层磁铁层主要由三个圆柱型的磁铁坑构成，每个坑里面有一个直径2mm，高2mm的圆柱形小磁铁，
其中三个圆柱型的磁铁坑位置和三个反应池位置一一对应；进样入口和样品缓冲液入口呈Y形相交与样品混合通道连接，样品混合通道下连清洗池；一抗入口通过通道分别从两边包围进样入口和样品缓冲液入口并以十字形与一抗与样品混合通道连接，一抗与样品混合通道上连清洗池，下连一抗孵育池；二抗入口通过通道分别从两边包围二抗孵育与显色池并以十字形与二抗与样品混合通道连接，二抗与样品混合通道上连一抗孵育池，下连二抗孵育与显色池。


2.按照权利要求1所述集成式外泌体检测芯片，其特征在于：所述顶层通道层通道高度为100μm-1mm，三个反应池直径为3mm-8mm，其中二抗孵育与显色池向上打通，其它通道宽度为250μm-1mm。


3.按照权利要求1所述集成式外泌体检测芯片的制备方法，其特征在于：按照以下步骤进行：使用au...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，陈雯雯，苏文涛，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21