分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法技术

本发明专利技术公开了一种分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法，将瑶鸡品系和绿壳蛋鸡品系进行杂交，采用基因聚合的策略，联合使用鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因的分子标记分别进行筛选，最终获得的纯系同时具有无鱼腥味和绿壳蛋特征。实验表明，本发明专利技术成功实现了具有多个优良性状(无鱼腥味和绿壳蛋)的鸡新品系的快速选育。本发明专利技术可应用于剔除鱼腥味和携带绿壳蛋性能的无鱼腥味绿壳蛋鸡配套系的快速简捷培育，以及相关配套系的性能研究与生产；并针对鱼腥味和绿壳蛋性状提供了分子标记的联合鉴定方法，以及获得的无鱼腥味绿壳蛋鸡品系的纯度验证分析。相对于现有技术，本发明专利技术具有快速、准确、便捷、高效、经济等特点。

The method of molecular marker assisted cultivation of green shell layer without fishy smell

【技术实现步骤摘要】
分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法
本专利技术属于家禽育种
，尤其涉及一种分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法。
技术介绍
近年来，国内外营养学家和医学家总结鸡蛋的营养价值和保健功能主要包括健脑益智、保护肝脏、防治动脉硬化、预防癌症、延缓衰老等五大方面。绿壳蛋在以上功能基础上，因其含有大量人体必不可少的维生素和矿物质及高生物价值蛋白质，在修复人体组织、形成新组织、消耗能量和参与复杂的新陈代谢过程等方面起着极其重要的作用。随着蛋鸡生产性能和人们生活水平的提高，消费者对鸡蛋品质的要求也逐渐提升，然而，鸡蛋鱼腥味问题严重影响了鸡蛋的风味和适口性。国内外利用传统选育方法已成功地培育了大量的畜禽品种。但是，传统育种主要凭借育种经验依据表型对后代进行选择，无法对目标基因的基因型进行直接选择，因此选择效率和准确性较低。而利用分子标记可从DNA水平上直接鉴定个体的基因型，避免了表型推测基因型不准确等缺点。无论质量性状还是连续变异的数量性状，利用分子标记辅助选择均可显著提高选择效率和准确性，加快育种进程。具体而言，分子标记辅助选择具有克服性状表型鉴定的困难、可在生长发育早期选择、控制同一性状的多个(等位)基因的利用、允许同时选择多个性状、性状评价和选择不具有破坏性、可提高回交育种效率等优越性。鱼腥味综合征是由位于鸡8号染色体上的含黄素单氧化酶3(FMO3)基因的一个错义突变导致机体不能正常分解食物中的三甲胺形成的，该突变位于FMO3基因的第7个外显子上，突变个体cDNA序列的第1034位碱基腺嘌呤核苷酸(A)被胸腺嘌呤(T)取代，这使得编码蛋白质的第329位氨基酸由苏氨酸(T)转变为丝氨酸(S)，导致酶功能的丧失。鸡蛋出现鱼腥味综合征是因为蛋黄中的三甲胺的含量比正常鸡蛋高10倍，由于鸡体内缺乏三甲胺氧化酶，导致三甲胺不能被氧化，从而沉积到蛋黄中，形成鱼腥味鸡蛋，散发出一种难闻的类似鱼腥味的气味。鸡蛋壳颜色是重要的蛋用性状，一直备受关注。鸡的绿壳性状是1号染色体上显性绿壳基因(Oocyan，O)作用的结果。鸡的绿壳基因(O)定位于1号染色体短臂上，它与内源病毒因子(ev1)及豆冠位点(P)连锁，它们在染色体上的排列顺序为P-evl-O。进一步研究发现鸡的绿壳性状是由有机阴离子转运多肽1B3基因(Solutecarrierorganican-iontransporterfamilymember1B3，SLCO1B3，位于1号染色体65319441～65338450bp)5′侧翼区插入鸟类逆转录酶病毒(EAV-HP，长度为4.2kb)所造成。当EAV-HP插入到SLCO1B3的5′侧翼区后，导致SLCO1B3基因在子宫部特异表达，从而使蛋壳颜色表现为绿壳。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速、准确、便捷、高效、经济的分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法，将瑶鸡品系和绿壳蛋鸡品系进行杂交，联合利用鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因的分子标记进行鉴定，保留F1代绿壳蛋杂合子个体，同时剔除携带有鱼腥味的杂合子的公鸡和母鸡，并根据鱼腥味和绿壳蛋表型进行验证与再次淘汰；留种的F1公母鸡杂合子进行横交；再次利用绿壳蛋分子标记进行筛选，保留F2代携带绿壳蛋纯合子基因型和剔除鱼腥味纯合子和杂合子基因型的个体，再次根据鱼腥味和绿壳蛋表型进行鉴定与淘汰，最终获得纯种的无鱼腥味绿壳蛋鸡品系；瑶鸡品系为瑶鸡品系公鸡，绿壳蛋鸡品为新杨绿壳蛋鸡的纯合子或杂合子母鸡；鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因分别为FMO3基因和SLCO1B3基因。上述分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法，包括以下步骤：(1)选择瑶鸡品系公鸡和新杨绿壳蛋鸡的纯合子或杂合子母鸡，以混精的方式进行杂交、收集种蛋、孵化，获得F1代幼雏；其中，由于绿壳蛋的相关调控基因为显性基因，所以具有绿壳蛋特征的母鸡个体可以为纯系个体，也可以为杂合子个体。但考虑到使用杂合子会产生更多的非绿壳蛋，造成更多的浪费，故选用绿壳蛋纯系母鸡个体最佳，可以减少非绿壳蛋鸡个体出现，降低饲养成本和人工浪费。(2)于F1代3-4周龄，采集血液并提取基因组DNA(参照《分子克隆实验指南IV》，以下DNA提取相同)，先后使用鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因的分子标记进行联合鉴定，剔除鱼腥味纯合子和杂合子基因型的公鸡和母鸡个体，同时保留绿壳蛋杂合子和纯合子基因型个体；根据孟德尔遗传规律确定；通过提前开展检测，可以减少中间饲养费用，考虑到发育早期血液的采集可能会影响记得发育，最好为4周龄进行。(3)于F1代28-32周龄母鸡产蛋高峰期，分别根据有无鱼腥味或蛋壳颜色(母鸡产蛋高峰期)等表型验证分子标记筛选结果，淘汰鱼腥味和绿壳蛋表型不符合要求的个体；产蛋高峰期是群体中产蛋个体数量最多的时期，因此此时期得到最好的观测结果。(4)使用留种的公鸡、母鸡个体以混精的方式进行横交，收集种蛋、孵化，获得F2代幼雏；(5)于F2代3-4周龄，采集血液并提取基因组DNA，先后使用鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因的分子标记进行联合鉴定，保留绿壳蛋纯合子基因型，同时剔除鱼腥味纯合子和杂合子基因型的个体；(6)于F2代28-32周龄母鸡产蛋高峰期，分别根据有无鱼腥味或蛋壳颜色(母鸡产蛋高峰期)等表型验证分子标记筛选结果，淘汰表型不符合要求的个体。联合鉴定采用的分子标记检测引物包括针对FMO3基因分子标记的上游引物和下游引物，以及针对SLCO1B3基因分子标记的引物F、引物R1和引物R2，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.5的碱基序列。联合鉴定的PCR反应条件和反应程序分别为：反应条件：：20.0μL反应体系，包括1.0UTaqDNA聚合酶、1.0μL10×buffer、50ng模板DNA、每条引物各3.0pmol/L、4种dNTP各2.0μmol/L；反应程序：94℃预变性5min；95℃30s，58℃退火温度30s，72℃30s，共计36个循环；72℃延伸5min。针对目前优良品种蛋鸡选育存在的问题，专利技术人建立了一种分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法，将瑶鸡品系和绿壳蛋鸡品系进行杂交，采用基因聚合的策略，联合使用鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因(FMO3基因和SLCO1B3基因)的分子标记分别进行筛选，最终获得的纯系同时具有无鱼腥味和绿壳蛋特征。选育流程中，先杂合子筛选，后纯合子筛选。为保证和提高鉴定结果的准确性，在分子标记鉴定的基础上进行表型验证与淘汰，表型验证与淘汰按照时间顺序分步操作，先筛选鱼腥味性状，然后筛选绿壳蛋性状。实验表明，本专利技术成功实现了具有多个优良性状(无鱼腥味和绿壳蛋)的鸡新品系的快速选育。本专利技术可应用于剔除鱼腥味和携带绿壳蛋性能的无鱼腥味绿壳蛋鸡配套系的快速简捷培育，以及相关配套系的性能研究与生产；并针对鱼腥味和绿壳蛋性状提供了分子标记的联合鉴定方法，以及获得的无鱼本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法，其特征在于：将瑶鸡品系和绿壳蛋鸡品系进行杂交，联合利用鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因的分子标记进行鉴定，保留F1代绿壳蛋杂合子个体，同时剔除携带有鱼腥味的杂合子的公鸡和母鸡，并根据鱼腥味和绿壳蛋表型进行验证与再次淘汰；留种的F1公母鸡杂合子进行横交；再次利用绿壳蛋分子标记进行筛选，保留F2代携带绿壳蛋纯合子基因型和剔除鱼腥味纯合子和杂合子基因型的个体，再次根据鱼腥味和绿壳蛋表型进行鉴定与淘汰，最终获得纯种的无鱼腥味绿壳蛋鸡品系；所述瑶鸡品系为瑶鸡品系公鸡，绿壳蛋鸡品为新杨绿壳蛋鸡的纯合子或杂合子母鸡；所述鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因分别为FMO3基因和SLCO1B3基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法，其特征在于：将瑶鸡品系和绿壳蛋鸡品系进行杂交，联合利用鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因的分子标记进行鉴定，保留F1代绿壳蛋杂合子个体，同时剔除携带有鱼腥味的杂合子的公鸡和母鸡，并根据鱼腥味和绿壳蛋表型进行验证与再次淘汰；留种的F1公母鸡杂合子进行横交；再次利用绿壳蛋分子标记进行筛选，保留F2代携带绿壳蛋纯合子基因型和剔除鱼腥味纯合子和杂合子基因型的个体，再次根据鱼腥味和绿壳蛋表型进行鉴定与淘汰，最终获得纯种的无鱼腥味绿壳蛋鸡品系；所述瑶鸡品系为瑶鸡品系公鸡，绿壳蛋鸡品为新杨绿壳蛋鸡的纯合子或杂合子母鸡；所述鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因分别为FMO3基因和SLCO1B3基因。


2.根据权利要求1所述的分子标记辅助培育无鱼腥味青脚麻羽绿壳蛋鸡的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)选择瑶鸡品系公鸡和新杨绿壳蛋鸡的纯合子或杂合子母鸡，以混精的方式进行杂交、收集种蛋、孵化，获得F1代幼雏；
(2)于F1代3-4周龄，采集血液并提取基因组DNA，先后使用鱼腥味和绿壳蛋性状相关基因的分子标记进行联合鉴定，剔除鱼腥味纯合子和杂合子基因型的公鸡和母鸡个体，同时保留绿壳蛋杂合子和纯合子基因型个体；
(3)于F1代28-32周龄母鸡产蛋高峰期，分别根据有无鱼腥味或蛋壳颜色表型验证分子标记筛选结果，淘汰鱼腥味和绿壳蛋表型不符合要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀荣，邓继贤，邹乐勤，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45