一种塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法及其应用，属于动物发病模型建立领域。提供的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法包括向家兔接种毒量不低于10

Establishment and application of a Seneca virus rabbit model

【技术实现步骤摘要】
一种塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法及其应用
本专利技术属于动物发病模型建立领域，具体涉及一种塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法及其应用，尤其是在疫苗或抗感染药物筛选过程中的应用。
技术介绍
塞内卡病毒(SenecavirusA，SVA)是一种主要感染猪的病毒，属于小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属。该病毒主要通过接触传播，可以引起猪的鼻吻、蹄部冠状带水疱病变，与口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等疾病在临床症状上极其相似，难以区分。该病毒对成年猪表现为亚临床感染、繁殖，猪在蹄冠和鼻部产生病变，或呈现隐性感染，这使得上市猪存在巨大风险，并且能够引起7日龄内新生仔猪死亡率高达30％～70％。我国对该病研究较晚，目前市场上还没有预防和控制该病毒的安全、高效的疫苗，都处于研发阶段。研发阶段动物实验尤为关键，然而，目前由于非洲猪瘟等猪传染病的影响，实验猪的采购十分困难且不再安全可靠，大大的制约了实验进度和疫苗或抗感染药物的开发。因此，构建SVA相关动物模型对疫苗或抗感染药物的开发至关重要，同时可以大大节省研发费用。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本专利技术一个方面提供一种塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法，包括对家兔接种塞内卡病毒液，其中所述塞内卡病毒液的接种毒量不低于108.5TCID50。上述塞内卡病毒液的毒价不低于107.5TCID50/0.1ml，接种量为≥1.0ml/只。上述塞内卡病毒液为SVV/CH/ZZ/2016CGMCCNo.14886的病毒液。上述接种采用滴鼻的方式进行接种。上述家兔的体重为2～3公斤。上述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法还包括确定所述塞内卡病毒家兔动物模型建立成功的步骤，具体为：接种后观察家兔唇部，若出现白色粉刺样的凸起，则确定所述塞内卡病毒家兔动物模型建立成功。上述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法还包括确定所述塞内卡病毒家兔动物模型建立成功的步骤，具体为：采集所述白色粉刺样的凸起，以及收集所述塞内卡病毒液分别进行提取RNA，并进行PCR检测，若扩增出目的条带，并且所述白色粉刺样的凸起的扩增目的条带与所述塞内卡病毒液的扩增目的条带一致，则确定所述塞内卡病毒家兔动物模型建立成功。上述PCR检测的引物为序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，目的条带的大小为129bp。本专利技术另一方面还提供一种塞内卡病毒家兔动物模型，其由上述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法获得，接种塞内卡病毒后的家兔唇部有白色粉刺样的凸起。上述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法或上述的塞内卡病毒家兔动物模型在筛选塞内卡病毒疫苗或抗塞内卡病毒药物中的应用也属于本专利技术的内容。基于以上技术方案提供的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法可以有效使用家兔代替实验猪建立塞内卡病毒动物模型，从源头消除非洲猪瘟等猪传染病带来的影响；同时本专利技术提供的动物模型建立方法采用家兔作为实验动物，相对于实验猪，家兔在饲养成本上相对较低，购买成本也相对较低，可以有效缩减成本。并且本专利技术建立的SVA家兔动物模型与以猪为实验动物的SVA模型的临床症状高度相似，在建立的SVA家兔动物模型中，粉刺样凸起是由塞内卡病毒引起的家兔发病症状，因此家兔能作为塞内卡病毒疫苗、药物研发的实验动物，应用中该模型还能够避免SVA的感染症状与口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等疾病症状的混淆，将猪SVA感染与猪口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等疾病区别开来。SVA家兔动物模型的建立方法操作简便，将为新型塞内卡病毒疫苗或抗塞内卡病毒药物的开发提供优化的评价方案和指标，具有十分重要的理论意义和应用价值。附图说明图1为粉刺样凸起的PCR检测结果；图2为粉刺样凸起的形态照片。具体实施方式本专利技术旨在建立一种塞内卡病毒家兔动物模型，以代替以猪为实验动物的模型，为新型塞内卡病毒疫苗或抗塞内卡病毒药物的开发提供评价方案和指标。通过以下具体实施方式详细说明本专利技术。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本专利技术生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本专利技术，但不应作为对本
技术实现思路
的限制。实施例1：塞内卡病毒液的制备该实施例选择使用SVV/CH/ZZ/2016CGMCCNo.14886(CN110551694A)作为种毒制备塞内卡病毒液，包括以下步骤：(1)将塞内卡病毒种毒接种于长满单层的PK-15细胞(猪肾细胞，金宇保灵生物药品有限公司提供)，置37℃的CO2培养箱中培养5日，反复冻融3次收获病毒培养液，记为F1代，置-20℃保存。取收获的病毒培养液F1代，按照10％(V/V)的含量接种已长满单层的PK-15细胞，置于37℃的CO2培养箱中培养，每日观察细胞病变(CPE)，接种后48小时收获病毒培养液液，记为F2代。继续按上述方法传代，传至出现典型病变(表现为细胞圆缩、聚合、出现空洞，甚至脱落)为止，该实施例中培养至F3代即出现典型病变。继续传代至F7代，为病变最典型的最低代次，收获病毒液，测定毒价为107.5TCID50/0.1ml。该过程由金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室完成。(2)对收获的病毒液进行RNA提取(采用RNA提取试剂盒，生工生物工程有限公司)：取200μl病毒液加入1.5ml离心管中，加入200μlBufferV-L，涡旋振荡混合均匀，静置5分钟；加入75μlBufferV-N，涡旋振荡混合均匀，12000rpm离心5分钟；将上清转移至新的2ml离心管中，加300μl异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6～8次，混合均匀，将其移入制备管，置于2ml离心管中，6000rpm/min离心1分钟；弃去滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加500μlBufferW1A，置温室静置1分钟，12000rpm离心1分钟；弃去滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加800μlBufferW2，12000rpm离心1分钟；弃去滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12000rpm离心1分钟；将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加40μl无酶水，室温静置1分钟，12000g离心1分钟洗脱RNA，-20℃冻存备用。(3)PCR检测收获的病毒液：将上述步骤(2)中提取的病毒液RNA，使用PCR方法鉴定SVA，方法如下：上游引物SVA-F：5’-TATCTCAGATCCCTGGCTGTC-3’(SEQIDNO:1)；下游引物SVA-R：5’-CCTGATGATCACATTGTTGAGC-3’(SEQIDNO:2)。反应体系：2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μl，TaKaRaExTaqHS0.5μl，PrimeScriptR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法，其特征在于，包括对家兔接种塞内卡病毒液，其中所述塞内卡病毒液的接种毒量不低于10

【技术特征摘要】
1.一种塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法，其特征在于，包括对家兔接种塞内卡病毒液，其中所述塞内卡病毒液的接种毒量不低于108.5TCID50。


2.根据权利要求1所述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法，其特征在于，所述塞内卡病毒液的毒价不低于107.5TCID50/0.1ml，接种量为≥1.0ml/只。


3.根据权利要求1或2所述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法，其特征在于，所述塞内卡病毒液为SVV/CH/ZZ/2016CGMCCNo.14886的病毒液。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的建立方法，其特征在于，所述接种采用滴鼻的方式进行接种。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法，其特征在于，所述家兔的体重为2～3公斤。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法，其特征在于，还包括确定所述塞内卡病毒家兔动物模型建立成功的步骤，具体为：接种后观察家兔唇部，若出现白色粉刺样的凸起，则确定...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐志涛，陈九连，路荣，方建国，高艳华，张燕红，杜宇荣，宋庆庆，赵丽霞，李雪峰，张云星，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙;15