本发明专利技术涉及一种一种白介素21蛋白(IL21)突变体及其应用，所述的突变体为，在野生型IL21的第16位ILE、第70位SER，都突变为CYS，并在两个突变的CYS之间形成二硫键。所述的野生型IL21蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还涉及包含所述的IL21蛋白突变体的融合蛋白，以及所述的IL21蛋白突变体或融合蛋白在制备药物中的应用，优选的，所述的药物是调节或激活免疫的药物或抗肿瘤药物。本发明专利技术还涉及所述的IL21蛋白突变体或融合蛋白在制备促进B细胞分化增殖，促进T细胞分化增殖，促进NK细胞分化增殖的制剂中的应用。
IL 21 mutant and its application
【技术实现步骤摘要】
白介素21蛋白(IL21)突变体及其应用
本专利技术属于医药
，具体而言，涉及一种白介素21蛋白(IL21)突变体及其应用。
技术介绍
针对肿瘤免疫治疗研究中的免疫抑制问题，细胞因子和小分子抑制剂治疗，能够起到免疫调节的作用，细胞因子和小分子抑制剂能针对抑制性细胞亚群，抑制其数量或功能，或者通过免疫刺激分子活化抗肿瘤效应细胞，增强患者的抗肿瘤免疫应答。IL2(白介素2)是免疫反应中的重要介导分子，也是已知最强有力的抗肿瘤细胞因子之一，具有广泛的生物学活性，IL2直接作用于胸腺T细胞，促进Treg细胞的分化，抑制自身免疫，也能够促进初始T细胞分化成为可被抗原刺激激活的效应T细胞与记忆T细胞，可帮助机体抵抗感染。然而，IL2的全身用药可导致较强的不良反应，使得IL2的治疗剂量受到限制[1-2]，而且血浆半衰期短(约0.5-2小时)[3]，在肿瘤局部微环境中不能达到治疗的最佳剂量，也限制了其临床应用。在细胞因子家族中，IL2、IL15和IL21同属于共受体γ链家族，都有促进T细胞、NK细胞活性，增强其杀伤靶细胞的作用，这些特性使它们在研究肿瘤免疫治疗中成为有吸引力的细胞因子[4-5]。IL21(白介素21)是2000年发现的Ⅰ型细胞因子，属于γc家族，由134个氨基酸组成，主要由CD4+T细胞亚群，如TH17细胞以及TFH(Tfollicularhelper)细胞分泌产生，NKT细胞也能分泌较高水平的IL21[19-20]。有报道IL21受体IL21R在T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞和单核/巨噬细胞表面均有表达，是具有广泛免疫调节作用的细胞因子。许多临床前实验指出，IL21通过多种机制抗肿瘤，包括先天免疫系统和获得性免疫系统[6]。IL21已被批准进入人体临床实验治疗黑色素瘤、肾癌，获得良好得治疗效果[7-8]；IL21可以增强NK细胞对西妥昔单抗预先包被的胰腺癌细胞的反应[9]；IL21与单克隆抗体Rituximab(anti-CD20)所构建融合蛋白在动物实验中显示可以直接诱导凋亡或通过效应效应细胞来杀伤非何杰金氏淋巴瘤(NHL)[10]。我们的前期研究发现：在乳腺癌小鼠模型中，IL21可以通过将M2巨噬细胞(具有增加肿瘤耐药和恶性的作用)转化为M1巨噬细胞(具有抗肿瘤功能)大幅提升抗体乳腺癌抗体赫赛汀的肿瘤杀伤效果[11]。但同时，在多项IL21临床应用研究中显示，虽然IL21毒副作用较相同剂量的IL2或IFN-α小，主要表现为发热、疲劳、头痛、皮疹等较轻症状，也有出现腹痛、血小板减少、低磷血症、肝功能损害等严重表现，但在30ug/kg通常给药量时，各种毒副作用的发生率仍达100％[12]，这是全身用药时需要慎重对待的问题。事实上，开展IL21临床应用研究多年，目前仍停留在临床前Ⅰ期、Ⅱ期阶段，存在毒副作用发生率高的问题是重要原因。为解决提高细胞因子在肿瘤局部的有效浓度从而避免全身性毒性反应的问题，有研究者利用抗体靶向性传递细胞因子，使细胞因子的免疫治疗能力与抗体的靶向性抗肿瘤反应结合起来，在肿瘤局部获得高浓度的细胞因子，有效刺激细胞免疫反应，这种将细胞因子与细胞特异性的抗体偶联，将其命名为免疫细胞因子[13]。但是，有临床研究发现IL21血浆半衰期较短，仅有约3.09小时[12]，即使IL21与单克隆抗体构建的融合蛋白分子量已达约180kD，血浆半衰期仍较短，IL21与Rituximab(anti-CD20)所构建融合蛋白在动物实验中血浆半衰期也仅有约18.94小时[10]，成药性仍然不高。因此，提高IL21稳定性是延长半衰期、提高成药性的重要条件。结构分析显示，IL21的蛋白构象存在稳定与不稳定两种构象，这是IL21半衰期短的一个原因；有报道表明通过将IL21的蛋白结构中不稳定区域替换为IL4(白介素4)的同源区域构建了一种嵌合体IL21/4，结果显示嵌合体IL21/4的蛋白构象单一稳定，而且生物学活性有提高[14]。在我们的前期工作中，已经建立了实现蛋白质构像体外控制的哺乳动物细胞表面蛋白质稳定展示系统，(参见CN201410803422，CN201810795499)，能够对蛋白进行理性设计突变及筛选、鉴定。在本专利技术中，我们使用该系统，对白介素21(IL21)的进行了稳定展示，并通过基于蛋白质结构分析的设计，优化并获得了一组突变体IL21蛋白。参考文献：1、RothJA,CristianoRJ,Genetherapyforcancer:whathavewedoneandwherearewegoing？J.Natl.CancerInst.1997；89:21-39.2、ZatloukalK,SchneebergerA,BergerMetal.Elicititionofasystemicandprotectiveanti-melanomaimmuneresponsebyanIL-2basedvaccine.Assessmentofcriticalcellularandmolecularparameters.J.Immunol.1995；154:3406-3419.3、LotzeMT,etal.Invivoadministrationofpurifiedhumaninterleukin2.I.Half-lifeandimmunologiceffectsoftheJurkatcellline-derivedinterleukin2.[J]Immunol.1985；134(1):157–66.4、Overwijk,W.W.,Schluns,K.S.FunctionsofγCcytokinesinimmunehomeostasis:Currentandpotentialclinicalapplications[J].ClinImmunol.2009；132(2):153-165.5、MalekTR,CastroI.Interleukin-2ReceptorSignaling:AttheInterfacebetweenToleranceandImmunity[J].Immunity.2010；33(2):153–165.6、RosanneS,WarrenJ.L.Interleukin-21:BasicBiologyandImplicationsforCancerandAutoimmunity[J].Annu.Rev.Immunol.2008.26:57–79.7、SchmidtH,BrownJ,MouritzenU,etal.SafetyandclinicaleffectofsubcutaneoushumanInterleukin-21inpatientswithmetastaticmelanomaorrenalrellcarcinoma:aphaseItrial[J].ClinCancerRes.2010；16(21):5312-9.8、DavisID,SkrumsagerBK,CebonJ,etal.An本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种白介素21(IL21)突变体，所述的突变体为：/n(1)将野生型IL21的氨基酸序列的第16位ILE、第70位SER，都突变为CYS，并在两个突变的CYS之间形成二硫键，所述的野生型IL21的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n或(2)将野生型IL21的氨基酸序列的第16位ILE、第17位VAL、第70位SER、第112位LYS的都突变为CYS，并且形成16-70、17-112两组二硫键；/n所述的野生型IL21的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种白介素21(IL21)突变体，所述的突变体为：
(1)将野生型IL21的氨基酸序列的第16位ILE、第70位SER，都突变为CYS，并在两个突变的CYS之间形成二硫键，所述的野生型IL21的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；
或(2)将野生型IL21的氨基酸序列的第16位ILE、第17位VAL、第70位SER、第112位LYS的都突变为CYS，并且形成16-70、17-112两组二硫键；
所述的野生型IL21的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.一种白介素21和白介素4嵌合体蛋白(IL21/4)的突变体，所述的突变体为：
(1)将白介素21和白介素4嵌合体(IL21/4)的氨基酸序列的第16位ILE、第70位SER，都突变为CYS，并在两个突变的CYS之间形成二硫键；
或(2)将白介素21和白介素4嵌合体(IL21/4)的氨基酸序列的第16位ILE、第17位VAL、第70位SER、第106位LYS的都突变为CYS，并且形成16-70、17-106两组二硫键；
所述的白介素21和白介素4嵌合体蛋白(IL21/4)的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：张信，赵云，杭海英，
申请(专利权)人：海珂分子北京科技有限责任公司，中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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