本发明专利技术涉及分子生物学检测领域，更具体的，涉及叶酸代谢能力检测领域。提供了一种组合物，其检测叶酸代谢能力；与此同时，还提供了所述组合物用于检测叶酸代谢能力的用途、包含所述组合物的试剂盒以及用于检测叶酸代谢能力的方法，使用本发明专利技术的组合物以及方法，可以实现一种通道同时检测两种SNP类型，实现了一管多测，节约了时间和成本，并且使得上机检测的样本能够增加。
Composition, kit and method for detecting polymorphism of human folate metabolism gene
【技术实现步骤摘要】
检测人叶酸代谢基因多态性的组合物、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学检测领域，更具体的，属于人叶酸代谢基因多态性检测领域。
技术介绍
叶酸是一种水溶性B族维生素，其代谢产生的活性结构-四氢叶酸，是影响体内同型半胱氨酸代谢的最主要因素。全世界已经公认，妇女围孕期增补叶酸可以预防胎儿神经管缺陷(NTDs)的初发及再发。由于叶酸与DNA的合成密切相关，妇女围孕期若摄入叶酸不足，则会导致同型半胱氨酸(HCY)向甲硫氨酸转化出现障碍，导致高HCY血症或低甲硫氨酸血症。高HCY血症可引起血管内皮损伤、促进血管平滑肌细胞增生，同时引起凝血和纤溶系统功能失调，使血液处于高凝状态。近年来研究发现，血浆中HCY水平升高与习惯性流产、胎盘早剥、胎儿生长受限、胎儿畸形、死胎、早产、低体重儿等现象的发生密切相关。此外，有研究证明妇女在怀孕的前6周内如果摄入叶酸不足，则生育无脑儿和脑脊柱裂的畸形儿的可能性会增加4倍。同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是由甲硫氨酸(methionine)脱甲基分解产生的一种具有细胞毒性的含硫氨基酸，在代谢过程中由于N5,10～亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)的活性低则会导致血浆Hcy含量增高，引起高同型半胱氨酸血症(HHcy)，而SLC19A1A80G位点突变可引起叶酸转运缺陷，进而使得对正在发育的胚胎，特别是叶酸穿过胎盘的运输有重要影响。而HHcy是心脑血管疾病、早产、脑梗死、唇腭裂、神经管畸形等的危险因子。对人类体细胞MTHFR基因的C677T、A1298C基因多态性、MTRR基因的A66G基因多态性以及SLC19A1基因的A80G基因多态性做检测，可以发现不同个体对叶酸的吸收利用水平，实现个性化增补叶酸。中国专利公开CN110257507A公开了一种孕期叶酸代谢检测方法，其中涉及MTHFRC677T位点、MTHFRA1298C位点(MTHFRS2位点)、MTRRA66G位点(MTRRS2位点)和SLC19A1A80G位点(SLC19A1S1位点)。但是其采用多重PCR-LDR技术结合遗传分析仪的毛细管电泳技术进行检测，此方法需要专业人员才能进行，并且所需检测时间较长，成本较高。因此，针对此问题，现有技术当中采用荧光定量PCR进行检测，中国公开CN108034710A公开了一种基于荧光定量PCR检测MTHFRC677T位点、MTHFRA1298C位点、MTRRA66G位点的方法，但其一个通道只能检测一种SNP类型，并且其只能实现一管一测，不能实现一管多测，使得上机检测样本受到限制，同时其也未能检测SLC19A1A80G位点。有鉴于此，本领域需要一种检测位点全面，可以实现一管多测，从而节约时间和成本，并且使得上机检测的样本增加的产品。
技术实现思路
有鉴于此，第一方面，本专利技术的提供一种能够检测叶酸代谢能力的组合物，所述组合物包括：第一组：检测MTHFRC677T位点的寡核苷酸，包括：如SEQIDNO:1所示的上游引物、如SEQIDNO:2所示的下游引物，以及如SEQIDNO:3和4所示的探针，和检测MTRRA66G位点的寡核苷酸，包括：如SEQIDNO:5所示的上游引物、如SEQIDNO:6所示的下游引物，以及如SEQIDNO:7和8所示的探针；第二组：检测NTHFRA1298C位点的寡核苷酸，包括：如SEQIDNO:9所示的上游引物、如SEQIDNO:10所示的上游引物，以及如SEQIDNO:11所示的下游引物，和检测SLC19A1A80G位点的寡核苷酸，包括如SEQIDNO:12所示的上游引物、如SEQIDNO:13所示的上游引物，以及如SEQIDNO:14所示的下游引物；其中，第一组与第二组内分别检测两种位点的4种SNP类型所采用的荧光报告基团互不相同且互不干涉。本专利技术的组合物能够检测叶酸代谢能力，不需要进行凝胶电泳或其他的一些专业分析，因为不需要专业人员使用。使用本专利技术的组合物中，能够同时适用全血样本和口腔拭子样本，同时采用荧光探针法和熔解曲线法使得一个通道可以同时检测两个SNP类型，这样，本专利技术的组合可以一管同时检测4个SNP位点8种类型，使得整个过程的操作都极其简单，结果读取过程通过扩增曲线和CT值即可以判定，节约了时间和成本，并且使得上机检测的样本能够增加，并且如实施例3所述，使用本专利技术组合物的检测结果与二代测序结果一致，表明本专利技术组合物具有很高的准确性。在本专利技术中，荧光报告基团可以互不干涉地选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5～TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。第一组寡核苷酸适用于荧光探针法，荧光基团在其探针上；第二组寡核苷酸适用于熔解曲线法，荧光基团在其上游引物上。进一步地，荧光探针以及具有荧光基团的引物还连有猝灭基团。猝灭基团可以互补干涉地选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB-λ、Dabcyl-λ、TAMRA，但不限于此。进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μmol/L；所述组合物中探针的用量为0.2～0.4μmol/L。第二方面，本专利技术提供了上述本专利技术的组合物在制备检测叶酸代谢能力的试剂盒中的用途。第三方面，本专利技术提供了一种检测叶酸代谢能力的试剂盒，所述试剂盒包括上述本专利技术的组合物。进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。进一步地，所述试剂盒还可以包括Mg2+、糖基化酶、dUTP。在具体的实施方案中，所述核酸释放试剂包括0.01～0.5mmol/L莎梵婷(surfactin)、100～200mmol/L氯化钾、50～200mmol/L氯化锂、质量/体积比为0.1％～1％十二烷基硫酸三乙醇胺、体积/体积比为0.1％～1％乙基苯基聚乙二醇(NP～40)、质量/体积比为0.01％～2％十二烷基磺酸钠、体积/体积比为0.05％～1％乙醇等组分中的一种或几种。通过使用这种核酸释放试剂，不需要进行核酸提取，方法及其简单，不需要纯化离心也不需要高温加热，仅需要加入核酸释放试剂进行吹打即可，同时使得核酸释放非常完全，便于后续的PCR扩增操作，提高了检测的准确度，并且也使得能够同时适用全血和口腔拭子的样本检测，可直接检测指尖血样本和口腔拭子样本，口腔拭子样本对人体没有伤害，仅用拭子刮取口腔内壁脱落细胞即可，样本常温保存，输送方便，可真正达到无创取样的目的。在具体的实施方案中，所述DNA聚合酶为5U/μL～15U/μL；所述糖基化酶为0.05U/μL～0.2U/μL。通过设置尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)+dUTP防污染体系，利用UNG酶将可能存在的PCR产物污染充分降解，以排除由此可能引起的假阳性结果，使检测结果更准确。在具体的实施方案中，所述试剂盒还具有阴性对照和阳性对照，其中，阳性对照包含8种SNP靶序列在内的质粒DNA混合液，具体如下：MTHFR基因677C质粒序列(SEQIDNO:15)：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种能够检测叶酸代谢能力的组合物，所述组合物包括：/n第一组：检测MTHFR C677T位点的寡核苷酸，包括：如SEQ ID NO:1所示的上游引物、如SEQ ID NO:2所示的下游引物，以及如SEQ ID NO:3和4所示的探针，和检测MTRR A66G位点的寡核苷酸，包括：如SEQ ID NO:5所示的上游引物、如SEQ ID NO:6所示的下游引物，以及如SEQ ID NO:7和8所示的探针；/n第二组：检测NTHFR A1298C位点的寡核苷酸，包括：如SEQ ID NO:9所示的上游引物、如SEQ ID NO:10所示的上游引物，以及如SEQ ID NO:11所示的下游引物，和检测SLC19A1A80G位点的寡核苷酸，包括如SEQ ID NO:12所示的上游引物、如SEQ ID NO:13所示的上游引物，以及如SEQ ID NO:14所示的下游引物；/n其中，第一组与第二组内分别检测两种位点的4种SNP类型所采用的荧光报告基团互不相同且互不干涉。/n
【技术特征摘要】
1.一种能够检测叶酸代谢能力的组合物，所述组合物包括：
第一组：检测MTHFRC677T位点的寡核苷酸，包括：如SEQIDNO:1所示的上游引物、如SEQIDNO:2所示的下游引物，以及如SEQIDNO:3和4所示的探针，和检测MTRRA66G位点的寡核苷酸，包括：如SEQIDNO:5所示的上游引物、如SEQIDNO:6所示的下游引物，以及如SEQIDNO:7和8所示的探针；
第二组：检测NTHFRA1298C位点的寡核苷酸，包括：如SEQIDNO:9所示的上游引物、如SEQIDNO:10所示的上游引物，以及如SEQIDNO:11所示的下游引物，和检测SLC19A1A80G位点的寡核苷酸，包括如SEQIDNO:12所示的上游引物、如SEQIDNO:13所示的上游引物，以及如SEQIDNO:14所示的下游引物；
其中，第一组与第二组内分别检测两种位点的4种SNP类型所采用的荧光报告基团互不相同且互不干涉。
2.根据权利要求1所示的组合物，其中，所述荧光报告基团可以且互不干涉地选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5～TAMRA、TET、CY3和JOE。
3.权利要求1或2所述的组合物在制备检测叶酸代谢能力的试剂盒中的用途。
4.一种用于检测叶酸代谢能力的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的组合物。
5.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：龙凤英，吴康，缪为民，戴立忠，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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