降高血压药物尼群洛尔用药指导基因检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种指导尼群洛尔的用药的方法和试剂盒。包括：根据待测的10个目的SNP位点分别设计多重扩增引物和延伸引物；配制多重扩增引物反应体系和延伸引物反应体系；在反应体系中，用多套引物同时分别对10个目的SNP位点进行扩增和单碱基延伸反应；将单碱基延伸反应后的产物进行飞行时间质谱分析，根据质谱峰所代表的不同分子量延伸引物的产物，鉴定不同药物代谢相关SNP的基因型，指导降高血压药物尼群洛尔的用药。同时提供利用该方法的检测试剂盒。本发明专利技术能同时检测10个降高血压药物尼群洛尔代谢相关的SNP位点，并具有成本低、无需合成探针、耗时短、结果分析简单便捷、应用领域极其广泛的优点。

Gene test kit of nitrendolol

【技术实现步骤摘要】
降高血压药物尼群洛尔用药指导基因检测试剂盒
本专利技术属于分子生物学检测领域，涉及一种利用质谱特征峰图检测多重PCR单碱基延伸产物的方法及其产品，该方法可以在3个多重PCR反应中同时检测多个PCR单碱基延伸扩增的寡核苷酸产物。更具体的说，该方法利用不同目的寡核苷酸片段在质谱分型过程中生成的不同的时间飞行质谱特征峰图，针对多个目的SNP位点同时进行检测，指导降高血压药物尼群洛尔的用药。
技术介绍
人类的遗传信息储存在基因组中，2002年国际合作项目人类基因组计划的最终完成，绘制出了人类基因组结构的精细图，为相关研究提供了参考序列。人类基因组序列共由30亿个碱基组成，大量研究表明，人群中>1％的遗传差异大约占基因组序列的0.1％左右，即大约300万个碱基的差异，在人群中超过1％的变异频率。这些差异极有可能是造成两个人之间个体差异的遗传因素。发现这些位点，可广泛地应用于遗传标记的研究、评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。在人类基因组中，约90％的差异是以单个核苷酸的形式体现出来的，这样的差异位点被称作单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)。SNP具有两个显著的特点：一是数目众多，据估计人类基因组中的SNP数目约在1100万左右，目前NCBIdbSNP数据库中已收录来源于人类基因组的SNP达1083万，其中经过确认的为644万(截至2007年8月22日)，如此大量的SNP方便了选择合适的位点进行疾病研究，也使得绝大多数基因组区域在SNP覆盖范围内；另外一个特点是SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表现形式(基因型)，这样很容易就能设计出高通量自动化的检测方法。正因为这两个特点，使得SNP位点越来越受到研究者的青睐，被誉为是继限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)和短串联重复序列(shorttandemrepeat，STR)之后的第三代分子标记物。人类基因组计划完成前后，基因组学研究的重点逐渐转向SNP领域，因此，SNP在遗传标记学、生物群体遗传学、生物分类学、遗传育种学、物种或人类进化学、法科学、药物基因组学等领域都有重要的应用。心血管疾病是全球人类健康的首要疾病负担。我国心血管病患病率处于持续上升阶段。高血压是最常见的心血管疾病之一，也是心血管病的主要危险因素。推算我国心血管病现患人数2.9亿，其中高血压占2.7亿。约70％的脑卒中和50％的心肌梗死的发生与血压升高有关，至少一半的心血管病死亡与高血压有关。根据历次全国性大规模高血压患病率调查，从1959年到2012年，大于等于18岁居民高血压患病率已由5.1％上升到25.2％，上升趋势明显，已成为我国重要疾病负担。因此，高血压的防治已经成为预防心血管疾病、保障国民健康的重要需求。临床上用于预测降压药物疗效的方法主要有两种，一种是医生经验性预测，医生首先会根据患者的一般性临床检查，经验性的选择一种降压药，当一段时期之后，发现疗效不好或副作用大，才会考虑加量或换药或合并用药；另一种预测方法是血压监测，而且已由静态发展为动态血压监测，可以实时有效监测血压，但目前动态血压监测技术本身存在不少局限性，动态血压值尚无统一标准，检查费价格较贵，并且不能真正预测某一药物的降压作用，更不能给医生选择药物提供准确的个体化信息。综上，现有的两种方法都存在一定的滞后性和盲目性，表现在医生在用药时不能根据个体差异进行选择药物、配伍和确定剂量，相对降低了临床用药、治疗的效率和安全性，增加了发生毒副作用和经济负担的风险。如今药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险的重要工具。通过检测药物代谢酶和药物靶点基因，可指导临床医生针对特定患者选择合适的降压药物和给药剂量，提高降压药物治疗的有效性和安全性。药物发挥作用的各个环节都可能因基因变异而表现出明显的差异性反应。降高血压药物尼群洛尔是一种钙离子拮抗剂，其机制为抑制钙离子移动到血管平滑肌细胞和心肌细胞。钙通道是细胞膜上对钙离子具有高度选择性通透能力的亲水性孔道。钙离子通过钙通道进入细胞内，参与细胞跨膜信号传导过程，介导兴奋-收缩偶联和兴奋-分泌偶联、维持细胞正常形态和功能完整性、调节血管平滑肌的舒缩活动等。钙拮抗剂在临床应用上存在一些争议。Furberg等人(“Nifedipine.Dose-relatedincreaseinmortalityinpatientswithcoronaryheartdisease”，Circulation，1995)认为钙离子拮抗剂尤其是短效的钙拮抗剂可增加冠心病发病甚至死亡的危险，也可增加癌症和消化道出血的危险。Pahor等人(“Healthoutcomesassociatedwithcalciumantagonistscomparedwithotherfirst-lineantihypertensivetherapies:ameta-analysisofrandomisedcontrolledtrials”，Lancet，2000)报道使用钙拮抗剂造成的急性心肌梗死、心力衰竭及主要心血管事件风险，明显高于利尿剂、β-受体阻滞剂、ACEI或可乐定。个体之间的遗传背景的差异是解释该现象的重要原因之一。由美国国立卫生研究院(NIH)创建的药物基因组学知识库(PharmGKB，ThePharmacogenetics&Pharmacogenomicsknowledgebase)，收集了史上最完整的与药物基因组相关的基因型和表型信息，并将这些信息系统地归类，是目前全球最重要的药物基因组学知识库，依据其制定的临床药物基因组实施协作组(CPIC，ClinicalPharmacogeneticsImplementationConsortium)是药物基因组学临床部署遵循的主要规范。研究表明，降高血压药物尼群洛尔存在多个代谢相关的基因位点。例如，国家卫生计生委合理用药专家委员会和中国医师协会高血压专业委员会共同编写的《高血压合理用药指南(第2版)》筛选出了PharmGKB和CPIC收录的与尼群洛尔的吸收、转运、代谢、效应相关的8个基因座位(AGTR1、KCNH2、PROX1、GALNT2、ABCB1、9p23、CACNA1C、LDLR)的10个多态性位点信息。进行降压药物选择指导的基因检测。根据检测的基因型结果所指向的用药建议，进行更适于个体遗传背景的降压药物种类及剂量选择，从而提高降压药物治疗的有效性和安全性。为了能更加全面的指导用药，需要同时对这些SNP位点进行分析，综合考虑才能给予更加可靠有效的用药指导。因此，以高灵敏、高通量为特点的SNP检验方法成为实现基因个体化用药的最优之选。与传统的SNP检验方法(荧光定量PCR，基因芯片，Sanger法)不同，近年发展起来的新型软电离生物质谱——基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，即Matrix-AssistedLaserDesorptionIonisationTime-Of-FlightMassSpec本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于判别降高血压药物尼群洛尔的用药型的引物组合物，其特征在于，该引物组合包括针对能判别尼群洛尔的10个SNP标记的PCR引物对和延伸引物，其中，PCR引物序列对选自如SEQ ID NO:1a-10a所示的序列，延伸引物序列选自如SEQ ID NO:1b-10b所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于判别降高血压药物尼群洛尔的用药型的引物组合物，其特征在于，该引物组合包括针对能判别尼群洛尔的10个SNP标记的PCR引物对和延伸引物，其中，PCR引物序列对选自如SEQIDNO:1a-10a所示的序列，延伸引物序列选自如SEQIDNO:1b-10b所示的序列。


2.权利要求1所述的引物组合物，其中所述SNP分别选自：
rs5186、rs1137617、rs340874、rs2144297、rs2144300、rs3213619、rs12346562、rs1104514、rs1051375、rs688。


3.权利要求1所述的引物组合物，其中上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括5-15个保护碱基序列，优选为10bp的tag：ACGTTGGATG。


4.权利要求1-3所述的引物组合物，其中延伸引物5'端可增加作为接头的碱基序列，其中优选为1-15个碱基，更优选1-3个碱基。


5.由权利要求1-4的引物组合物所制备的用于判别尼群洛尔用药型的检测产品，包括：
(1)用于PCR的反应试剂，包括：上述扩增引物对，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；
(2)用于PCR产物纯化的试剂；
(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：上述延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶(SAP酶)，ddNTPs，...

【专利技术属性】
技术研发人员：马庆伟，刘昕超，钟逾，
申请(专利权)人：北京毅新博创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11