用于对细胞内ATP进行活细胞分析的方法和组合物技术

本文公开ATP生物传感器融合蛋白和其用于分析细胞中的ATP含量的用途。

Method and composition for living cell analysis of intracellular ATP

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于对细胞内ATP进行活细胞分析的方法和组合物交叉参考本申请主张2018年3月9日提交的美国临时专利申请第62/640983号的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
技术介绍
监测药物诱导的代谢扰动的标准途径受限于提供基于群体的测量和有限的动力学信息的端点分析。根据本公开的方面，提供能够对细胞ATP含量进行直接、自动化活细胞分析的经遗传编码的ATP传感器以及使用方法。
技术实现思路
在一个方面中，公开了融合蛋白，其包含通式X1-X2-X3-X4-X5的多肽，其中：X1和X5中的一个包含具有受体激发波长和FRET发射波长的荧光共振能量传递(FRET)受体多肽，并且X1和X5中的另一个包含具有供体激发波长和供体发射波长的FRET供体多肽。X2和X4独立地是任选的氨基酸接头；并且X3包含ATP结合蛋白；其中ATP结合蛋白对ATP的结合引起所述FRET受体多肽与所述FRET供体多肽的相互作用。在一个实施例中，X1包含FRET受体多肽并且X5包含FRET供体多肽；在另一个实施例中，X1包含FRET供体多肽并且X5包含FRET受体多肽。在各种实施例中，X2为长度在1到2个氨基酸之间的氨基酸接头，或不存在。在其它实施例中，X2为选自由以下组成的群组的氨基酸接头：A、S、P、V、T、TS、ID，或其中X2不存在。在其它实施例中，X4为长度在1到5个氨基酸之间的氨基酸接头，或其中X4不存在。在其它实施例中，X4为选自由以下组成的群组的氨基酸接头：AT、A、SA、GA、FF、PPPP(SEQIDNO:20)、FL、GTSG(SEQIDNO:21)、P、S、ANEFM(SEQIDNO:22)或其中X4不存在。在各种实施例中，X2和X4都是A；X2是S并且X4是A；X2不存在并且X4是FF；X2是V并且X4是FL；X2是T并且X4是GTSG(SEQIDNO:21)；或X2是S并且X4是SA。在另一实施例中，X2和X4不包括任何脯氨酸残基。在其他实施例中，所述FRET受体多肽具有500到560nm范围内的最大受体激发波长和530到580nm范围内的受体最大发射波长。在其它实施例中，所述FRET受体多肽包含沿一或多种SEQIDNO:1-3的所述氨基酸序列的长度至少90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％一致并且在发色团处一致的氨基酸序列。在另一实施例中，存在所述FRET受体多肽中的所有任选的氨基酸残基。在一个实施例中，所述FRET供体多肽具有450到500nm范围内的最大供体激发波长和480到515nm范围内的最大供体发射波长。在其他实施例中，所述FRET供体多肽包含沿SEQIDNO:4的所述氨基酸序列的长度至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致并且在所述发色团处一致的氨基酸序列。在其它实施例中，X3包含ATP结合蛋白，其包含沿选自由SEQIDNO:5-6的群组的所述氨基酸序列的长度至少65％、67％、68％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的所述氨基酸序列。在另一个实施例中，所述融合蛋白包含沿选自由SEQIDNO:7-11组成的群组的所述氨基酸序列的长度至少90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在另一方面中，公开对照融合蛋白，其包括本文所公开的所述融合蛋白和其组分的所有实施例和实施例的组合，不同之处在于X3包含不结合到ATP的对照蛋白。在一个实施例中，X3包含沿SEQIDNO:12的所述氨基酸序列的长度至少65％、67％、68％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，其中SEQIDNO:12的所述带下划线和粗体的残基必须是K。在其他实施例中，所述对照融合蛋白包含沿SEQIDNO:13的所述氨基酸序列的长度至少65％、67％、68％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，其中SEQIDNO:13所述带下划线和粗体的残基必须是K。在另一方面中，公开编码本文所公开的任何实施例或实施例的组合的所述融合蛋白或对照蛋白的多核苷酸。在其它方面，本公开提供编码本公开的所述多核苷酸的表达载体，其中所述多核苷酸可操作地连接到能够引导所述多核苷酸表达的启动子序列，和包含本文所公开的任何实施例或实施例的组合的所述多核苷酸或表达载体的重组宿主细胞。在一个实施例中，所述宿主细胞为稳定转化体细胞系的细胞。在其它方面，本公开提供包含本文所公开的任何实施例或实施例的组合的一或多种融合蛋白和一或多种对照融合蛋白的试剂盒。在另一方面，本公开提供用于测定所关注的细胞中ATP的含量的所述融合蛋白的用途的方法。在一个实施例中，所述分析ATP的方法包含：(a)在一或多个第一细胞中表达本文中公开的任何实施例或实施例的组合的所述融合蛋白，并且产生选自由以下组成的群组的一或多个图像：(i)在使所述一或多个第一细胞暴露于具有所述供体多肽激发波长的光时，通过侦测由从所述一或多个第一细胞发射的具有所述FRET受体多肽发射波长的光产生的荧光信号而产生的第一荧光图像；和/或(ii)在使所述一或多个第一细胞暴露于具有所述受体多肽激发波长的光时，通过侦测由从所述一或多个第一细胞发射的具有所述FRET受体多肽发射波长的光产生的荧光信号而产生的第二荧光图像；和/或(iii)在使所述一或多个第一细胞暴露于具有所述供体多肽激发波长的光时，通过侦测由从所述一或多个第一细胞发射的具有所述FRET供体多肽发射波长的光产生的荧光信号而产生的第三荧光图像；和/或(b)通过比较所述第一荧光图像、所述第二荧光图像和/或所述第三荧光图像中的荧光信号的输出来确定所述一或多个第一细胞中的FRET比；其中所述一或多个第一细胞中ATP的水平与所确定的FRET比成比例。在一个实施例中，所述方法进一步包含在一或多个第一细胞中表达本文所公开的任何实施例或实施例的组合的所述对照融合蛋白，并且侦测由从所述一或多个第一细胞发射的具有所述受体发射波长的光产生的对照信号。在一个实施例中，侦测所述对照信号包含(c)在一或多个对照细胞(如所述第一细胞或第二细胞)中表达本文所公开的任何实施例或实施例的组合的所述对照融合蛋白，并且产生选自由以下组成的群组的一或多个图像：(i)在使所述一或多个对照细胞暴露于具有所述供体多肽激发波长的光时，通过侦测由从所述一或多个对照细胞发射的具有所述FRET受体多肽发射波长的光产生的荧光信号而产生的第四荧光图像；和/或(ii)在使所述一或多个对照细胞暴露于具有所述受体多肽激发波长的光时，通过侦测由从所述一或多个对照细胞发射的具有所述FRET本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其包含通式X1-X2-X3-X4-X5的多肽，其中：/nX1和X5中的一个包含具有受体激发波长和FRET发射波长的荧光共振能量传递(FRET)受体多肽，并且X1和X5中的另一个包含具有供体激发波长和供体发射波长的FRET供体多肽；/nX2和X4独立地是任选的氨基酸接头；并且/nX3包含ATP结合蛋白；/n其中所述ATP结合蛋白对ATP的结合引起所述FRET受体多肽与所述FRET供体多肽的相互作用。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180309 US 62/640,9831.一种融合蛋白，其包含通式X1-X2-X3-X4-X5的多肽，其中：
X1和X5中的一个包含具有受体激发波长和FRET发射波长的荧光共振能量传递(FRET)受体多肽，并且X1和X5中的另一个包含具有供体激发波长和供体发射波长的FRET供体多肽；
X2和X4独立地是任选的氨基酸接头；并且
X3包含ATP结合蛋白；
其中所述ATP结合蛋白对ATP的结合引起所述FRET受体多肽与所述FRET供体多肽的相互作用。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中X1包含FRET受体多肽并且X5包含FRET供体多肽。


3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中X1包含FRET供体多肽并且X5包含FRET受体多肽。


4.根据权利要求1到3中任一项所述的融合蛋白，其中X2为长度在1-2个氨基酸之间的氨基酸接头，或不存在。


5.根据权利要求1到3中任一项所述的融合蛋白，其中X2为长度为1个氨基酸的氨基酸接头，或不存在。


6.根据权利要求1到3中任一项所述的融合蛋白，其中X2为长度为1个氨基酸的氨基酸接头。


7.根据权利要求1到6中任一项所述的融合蛋白，其中X2为选自由A、S、P、V、T、TS、ID组成的群组的氨基酸接头，或其中X2不存在。


8.根据权利要求1到6中任一项所述的融合蛋白，其中X2为选自由A、S、V、T、TS和ID组成的群组的氨基酸接头。


9.根据权利要求1到6中任一项所述的融合蛋白，其中X2为选自由A、S、V和T组成的群组的氨基酸接头。


10.根据权利要求1到9中任一项所述的融合蛋白，其中X4为长度在1-5个氨基酸之间的氨基酸接头，或其中X4不存在。


11.根据权利要求1到9中任一项所述的融合蛋白，其中X4为长度在1-4个氨基酸之间的氨基酸接头，或其中X4不存在。


12.根据权利要求1到11中任一项所述的融合蛋白，其中X4为长度在1-2个氨基酸之间的氨基酸接头。


13.根据权利要求1到12中任一项所述的融合蛋白，其中X4为选自由以下组成的群组的氨基酸接头：AT、A、SA、GA、FF、PPPP(SEQIDNO:20)、FL、GTSG(SEQIDNO:21)、P、S、ANEFM(SEQIDNO:22)，或其中X4不存在。


14.根据权利要求1到12中任一项所述的融合蛋白，其中X4为选自由以下组成的群组的氨基酸接头：AT、A、SA、GA、FF、FL、P和S。


15.根据权利要求1到12中任一项所述的融合蛋白，其中X4为选自由以下组成的群组的氨基酸接头：A、FF、FL和GTSG(SEQIDNO:21)。


16.根据权利要求1到15中任一项所述的融合蛋白，其中X2和X4都是A。


17.根据权利要求1到15中任一项所述的融合蛋白，其中X2为S并且X4为A。


18.根据权利要求1到15中任一项所述的融合蛋白，其中X2不存在并且X4为FF。


19.根据权利要求1到15中任一项所述的融合蛋白，其中X2为V并且X4为FL。


20.根据权利要求1到15中任一项所述的融合蛋白，其中X2为T并且X4为GTSG(SEQIDNO:21)。


21.根据权利要求1到15中任一项所述的融合蛋白，其中X2为S并且X4为SA。


22.根据权利要求1到21中任一项所述的融合蛋白，其中X2和X4不包括任何脯氨酸残基。


23.根据权利要求1到22中任一项所述的融合蛋白，其中所述FRET受体多肽具有500到560nm范围内的最大受体激发波长和530到580nm范围内的受体最大发射波长。


24.根据权利要求1到23中任一项所述的融合蛋白，其中所述FRET受体多肽包含沿SEQIDNO:1-3中的一种或多种的氨基酸序列的长度至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致并且在发色团处一致的氨基酸序列。


25.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述FRET受体多肽中存在所有任选的氨基酸残基。


26.根据权利要求1到25中任一项所述的融合蛋白，其中所述FRET供体多肽具有450到500nm范围内的最大供体激发波长和480到515nm范围内的最大供体发射波长。


27.根据权利要求1到26中任一项所述的融合蛋白，其中所述FRET供体多肽包含沿SEQIDNO:4的氨基酸序列长度至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致并且在所述发色团处一致的氨基酸序列。


28.根据权利要求1到27中任一项所述的融合蛋白，其中X3包含ATP结合蛋白，其包含沿选自由SEQIDNO:5-6组成的群组的氨基酸序列的长度至少65％、67％、68％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。


29.根据权利要求1到28中任一项所述的融合蛋白，其包含沿选自由SEQIDNO:7-11组成的群组的氨基酸序列的长度至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。


30.一种对照融合蛋白，其包含通式X1-X2-X3-X4-X5的多肽，其中：
X1和X5中的一个包含具有受体激发波长和FRET发射波长的荧光共振能量传递(FRET)受体多肽，并且X1和X5中的另一个包含具有供体激发波长和供体发射波长的FRET供体多肽；
X2和X4独立地是任选的氨基酸接头；并且
X3包含不结合到ATP的对照蛋白。


31.根据权利要求30所述的对照融合蛋白，其中X1包含FRET受体多肽并且X5包含FRET供体多肽。


32.根据权利要求30所述的对照融合蛋白，其中X1包含FRET供体多肽并且X5包含FRET受体多肽。


33.根据权利要求30到32中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2为长度在1-2个氨基酸之间的氨基酸接头，或不存在。


34.根据权利要求30到32中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2为长度为1个氨基酸的氨基酸接头，或不存在。


35.根据权利要求30到32中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2为长度为1个氨基酸的氨基酸接头。


36.根据权利要求30到35中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2为选自由A、S、P、V、T、TS、ID组成的群组的氨基酸接头，或其中X2不存在。


37.根据权利要求30到35中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2为选自由A、S、V、T、TS和ID组成的群组的氨基酸接头。


38.根据权利要求30到35中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2为选自由A、S、V和T组成的群组的氨基酸接头。


39.根据权利要求30到38中任一项所述的对照融合蛋白，其中X4为长度在1-5个氨基酸之间的氨基酸接头，或其中X4不存在。


40.根据权利要求30到38中任一项所述的对照融合蛋白，其中X4为长度在1-4个氨基酸之间的氨基酸接头，或其中X4不存在。


41.根据权利要求30到40中任一项所述的对照融合蛋白，其中X4为长度在1-2个氨基酸之间的氨基酸接头。


42.根据权利要求30到41中任一项所述的对照融合蛋白，其中X4为选自由以下组成的群组的氨基酸接头：AT、A、SA、GA、FF、PPPP(SEQIDNO:20)、FL、GTSG(SEQIDNO:21)、P、S、ANEFM(SEQIDNO:22)，或其中X4不存在。


43.根据权利要求30到41中任一项所述的对照融合蛋白，其中X4为选自由以下组成的群组的氨基酸接头：AT、A、SA、GA、FF、FL、P和S。


44.根据权利要求30到41中任一项所述的对照融合蛋白，其中X4为选自由以下组成的群组的氨基酸接头：A、FF、FL和GTSG(SEQIDNO:21)。


45.根据权利要求30到44中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2和X4都是A。


46.根据权利要求30到44中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2为S并且X4为A。


47.根据权利要求30到44中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2不存在并且X4为FF。


48.根据权利要求30到44中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2为V并且X4为FL。


49.根据权利要求30到44中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2为T并且X4为GTSG(SEQIDNO:21)。


50.根据权利要求30到44中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2为S并且X4为A。


51.根据权利要求30到50中任一项所述的对照融合蛋白，其中X2和X4不包括任何脯氨酸残基。


52.根据权利要求30到51中任一项所述的对照融合蛋白，其中所述FRET受体多肽具有500到560nm范围内的最大受体激发波长和530到580nm范围内的FRET最大发射波长。


53.根据权利要求30到52中任一项所述的对照融合蛋白，其中所述FRET受体多肽包含沿SEQIDNO:1-3的氨基酸序列的长度至少90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％一致并且在发色团处一致的氨基酸序列。


54.根据权利要求53所述的对照融合蛋白，其中所述FRET受体多肽中存在所有任选的氨基酸残基。


55.根据权利要求30到54中任一项所述的对照融合蛋白，其中所述FRET供体多肽具有450到500nm范围内的最大供体激发波长和480到515nm范围内的最大供体发射波长。


56.根据权利要求30到55中任一项所述的对照融合蛋白，其中所述FRET供体多肽包含沿SEQIDNO:4的氨基酸序列的长度至少85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致并且在所述发色团处一致的氨基酸序列。


57.根据权利要求30到56中任一项所述的对照融合蛋白，其中X3包含沿SEQIDNO:12的氨基酸序列的长度至少65％、67％、68％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，其中带下划线和粗体的残基必须是K。


58.根据权利要求30到57中任一项所述的对照融合蛋白，其包含沿SEQIDNO:13的氨基酸序列的长度至少65％、67％、68％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，其中带下划线和粗体的残基必须是K。


59.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1到29中任一项所述的融合蛋白。


60.一种表达载体，其编码根据权利要求59所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接到能够引导所述多核苷酸表达的启动子序列。


61.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求59所述的多核苷酸或根据权利要求60所述的表达载体。


62.根据权利要求61所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为稳定转化体细胞系的细胞。


63.一种多核苷酸，其编码根据权利要求30到5...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·阿普多恩，C·施拉姆，G·菲罗诺夫，K·施罗德，
申请(专利权)人：埃森仪器公司dba埃森生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US