siRNA和透膜肽联合治疗肝癌的用途制造技术

本发明专利技术涉及siRNA和透膜肽联合治疗肝癌的用途。其中siRNA具有极高的抑制效率。透膜肽与siRNA一起能够显著提高转染效率，二者联合使用能够使得癌症抑制效果得到大大增强，具有较好的应用前景。

The application of siRNA and transmembrane peptide in the treatment of liver cancer

【技术实现步骤摘要】
siRNA和透膜肽联合治疗肝癌的用途
本专利技术涉及生物领域，具体的涉及癌症相关领域，更具体的涉及siRNA和透膜肽联合治疗肝癌的用途。
技术介绍
肝细胞肝癌（HCC）是肝癌中最常见的病理类型。在世界范围内，肝癌患者死亡率在所有癌症总死亡率中排第２位。特别是在东亚、东南亚、非洲及欧洲南部，肝癌的发病率、死亡率仍呈上升趋势。中国每年肝癌发病和死亡患者约占全球的一半。传统手术治疗对于部分HCC患者的病情改善有明显效，但相当数量的患者对治疗不耐受，远期复发进展。因此，作为未来精准治疗的关键，HCC相关调控因子成为目前研究的重点。lncRNA是一类长度超过200ｎt的内源性RNA，在表观遗传水平、转录过程中发挥了重要的调控作用。根据与邻近编码RNA的位置关系，lncRNA可分为５类：正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、内含子源性lncRNA、基因间lncRNA。lncRNA空间和组织形式上的多样性使其有多种功能。在细胞核内，lncRNA可以参与染色质的相互作用、转录调控与RNA加工过程；在细胞质内，lncRNA在转录产物的修饰、翻译过程的调节与信号通路的调控中扮演重要角色。由于lncRNA长度大于200nt，可以折叠为复杂的高级结构，其作用模式在多种情况下脱离了作为核苷酸序列的一级结构基础（与同源RNA序列直接结合），而偏向了二级或更高级结构。目前，已有多篇文献报道，HCC相关的lncRNA以多种形式参与HCC进展调控。HCC的发生与发展的病理生理过程十分复杂，受机体多种因素调节。基于现有的数据显示，多种lncRNA的异常表达在其中扮演十分重要的角色，研究较多的lncRNA包括ＭＡＬＡＴ１、ＵＣＡ１、ＨＯＳＴ２、ＨＯＴＴＩＰ等。近来的一些较新的研究，也筛选了一些新的指标，并对相关的调控功能进行探讨。如Yang等完成的一项最新重要研究中，筛查了来自20名HCC患者的60份临床样本，匹配阵列分析显示，有235种lncRNA的表达异常与拷贝数变异及DNA甲基化有关，而这些表达异常的lncRNA主要调控靶点集中于与细胞粘附、免疫应答及细胞代谢相关的基因。陈思思等采用荧光定量PCR检测检测96例肝癌癌灶组织及癌旁组织中lncRNACCAT1的表达情况，并分析与各临床病理因素以及患者预后的相关性。结果lncRNACCAT1在肝癌癌灶组织表达升高;肝癌癌灶组织中lncRNACCAT1表达量和门静脉癌栓、TNM分期等因素相关。进一步生存分析发现lncRNACCAT1表达阳性者术后平均生存时间(32.1个月，95%CI:26.3～38.0个月)明显短于阴性患者(47.2个月，95%CI:42.5～52.0个月)，差异有统计学意义(χ2=7.607，P=0.006)。并且lncRNACCAT1表达是肝癌患者总体生存的独立危险因素。结论lncRNACCAT1表达在肝癌发生、发展中发挥重要作用;lncRNACCAT1表达是肝癌患者的独立预后因素。许绍林运用RT-PCR技术检测45例原发性肝细胞癌新鲜组织中PCAT-14的表达水平；运用原位杂交技术检测130例原发性肝细胞癌患者组织切片中PCAT-14的表达水平，并运用卡方检验、COX回归模型、Kaplan-Meier生存曲线分析PCAT-14表达水平与原发性肝细胞癌患者临床病理因素及长期预后的关系，结果发现45对原发性肝细胞癌新鲜组织标本中35对癌组织表达水平较高，且癌组织中平均表达水平明显高于癌旁组织；130例原发性肝细胞癌患者切片中98例高表达，结果显示PCAT-14的表达水平与肝癌TMN分期、肿瘤大小以及转移呈正相关性，肝癌组织切片PCAT-14较高表达的患者预后相对较差，总体生存率明显低于PCAT-14较低表达的患者。CN107213471A中研究发现了长链非编码lncRNA-MUF在肝癌细胞中的上调表达非常显著。通过干涉肝癌细胞中lncRNA-MUF的表达后，发现干涉lncRNA-MUF的表达能够显著抑制体外肝癌干细胞球的形成和体内肝癌肿瘤的形成。但是该效果还有改进的空间。
技术实现思路
本专利技术提供一种能够抑制lncRNA-MUF的siRNA，其序列如TGGATTCCACACCCTTCTA所示（SEQIDNO:1）。研究发现，SEQIDNO：1所示的核苷酸序列沉默lncRNA-MUF的效率比CN107213471A中提供的沉默效率最高的GCCCTCGAGAAGTGTCTAA(SEQIDNO:2)效率还要高。此外，本专利技术还提供一种增强siRNA干扰效率的方法，其中包括在所述siRNA的5’端还添加透膜肽序列以及增强子序列，该序列不仅能够增强siRNA的表达效率，同时还能够提高所述siRNA序列的透过细胞膜的效率进而提高抑制效率。所述透膜肽的氨基酸序列的长度总计为5-50个氨基酸，优选总计为10-45个氨基酸，更优选总计为15-45个氨基酸；其中，任选地，1，2，3，4或5个氨基酸被取代，缺失和/或添加而不丧失所述肽的细胞穿透能力，或这种片段的变体包括或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自SEQIDNO:3，或其序列变体而不丧失所述肽的细胞穿透能力，优选具有0，1，2，3，4或5个氨基酸取代，缺失和/或添加而不丧失所述肽的细胞穿透能力的序列变体。更具体的，所述透膜肽的序列为TRF-1：RRWKACRRWVADRKSRARRWPLPQHYRERRW（SEQIDNO:3），其中所述透膜肽采用C端巯基乙胺化和N端乙酰化修饰。本专利技术的透膜肽是专利技术人通过研究发现的，该透膜肽富含R和W氨基酸，可自发地与带电情况不同的细胞膜单层磷脂结合，透膜肽与siRNA复合物不需要特定的膜电位，即可与细胞膜上的磷脂直接相互作用，改变细胞膜的稳定性，当复合物进入细胞后细胞膜则迅速封闭，并不改变膜的完整性和生物活性。本专利技术提供的透膜肽能够大幅度的提高siRNA的转染效率，作为载体工具，在基因治疗中具有较大的应用价值。本专利技术进一步的提供siRNA转染的方法，将TRF-1透膜肽与siRNA按照质量比22:1（μg：μg）用培养基混合均匀静止20min后加入到细胞培养板中，4h后吸去转染培养基，用PBS洗二遍，每孔加入500ul完全培养基后置于5%CO2、37℃的细胞培养箱培养后即得到转染后的细胞。本专利技术另外提供一种组合物，其含有siRNA和TRF-1透膜肽。更具体的，所述组合物中还包括药物辅料。药物辅料为现有技术，比如缓冲液、生理盐水等。本专利技术还提供一种药物组合物用于制备治疗肝癌的药物中的用途，其中所述组合物含有SEQIDNO：1所示的siRNA和SEQIDNO:3所示的透膜肽。在某些实施例中，所述核酸可被制成单位剂量的可注射形式，例如溶液、悬液或乳液。适于注射的药物制剂通常为无菌水性溶液和分散体系。用于可注射制剂的载体可为溶剂或分散介质，含例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适混合物。本领域技术人员可容易地确定将在本专利技术方法中给予的组合物中的细胞和可选添加剂、媒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种siRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种siRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.权利要求1所述的siRNA以及SEQIDNO：3所示的透膜肽的组合在用于制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗肝癌。


3.如权利要求2所述的用途，其特征在于siRNA以及SEQIDNO：3所示的透膜肽使用时按照25:1重量比来使用。


4.根据权利要求3所述的用途，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王阳，曹帅，
申请(专利权)人：北京瀚梅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11